[發明專利]一種結核分枝桿菌ESAT?6蛋白檢測試劑盒、制備方法以及使用方法

有效

• 申請號: 201510202992.0
• 申請日: 2015-04-23
• 公開（公告）號: CN104807993B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 周艷容;陳晨;王小晉;王冰;李燕;明宏艷
• 申請（專利權）人: 廣東國際旅行衛生保健中心（廣東出入境檢驗檢疫局口岸門診部）;中華人民共和國淮安出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/68;G01N21/359
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 谷慶紅

1.一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由近紅外熒光染料標記的單克隆抗體、多克隆抗體包被的納米磁珠、磁性分離器、蛋白標準品、緩沖液組成；其中，近紅外熒光染料標記的單克隆抗體為鼠抗ESAT-6；包被納米磁珠的多克隆抗體為鼠多抗ESAT-6。建立ESAT-6蛋白標準品梯度濃度和熒光發射值之間的工作曲線，將所測得的發射熒光強度，代入方程即可完成樣品中目標蛋白含量的定量(定性)檢測。

2.根據權利要求1所述的一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述近紅外熒光染料為激發光波長為777nm,發射光波長為790nm的熒光分子，優選NHS活化的近紅外熒光染料DyLight800。

3.根據權利要求1所述的一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測試劑盒的制備方法，其特征在于步驟如下：

(1)制備近紅外熒光染料標記的ESAT-6單克隆抗體；

將Dylight800(購自Thermofisher公司)用PBS緩沖液(PH7.4)稀釋10倍，取1.4μL與20μg鼠抗ESAT-6單克隆抗體(購自Pierece公司)1mg/ml輕柔混合均勻后于室溫避光反應2小時；反應結束后，將標記產物放入透析袋中，4℃，PBS緩沖液透析4小時。標記好的抗體溶液中添加終濃度為1.5％BSA和0.1％Tween20,疊氮化鈉0.1‰，4℃保存；使用前將標記產物以PBS稀釋2500倍；

(2)制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠(購自武漢哇哇噻納技術開發有限公司北京生物技術研究所)；

1)納米磁珠的預處理：

輕輕混勻磁珠懸浮液，吸取0.01ml懸浮液(25mg/ml)加入1.5ml?EP試管中；再加入0.1ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復上述步驟1次；

加入1ml?0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0,MES)，重懸磁珠；

2)納米磁珠的活化

將上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗滌2次，棄上清；

臨用前配置終濃度為0.1M的MES，其內含EDC和NHS的濃度均為40g/L(加入上述兩種物質后，置于振蕩器上充分混勻15分鐘，待用)。用該液重懸磁珠；

用磁板吸附磁珠，棄上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，棄上清；

3)磁珠與蛋白的鏈接；

在已處理好的磁珠中加入50μL?ESAT-6多克隆抗體(1mg/ml)(購自Pierece公司)和500μL?PBS(PH5.5)，混勻，室溫，置于搖床上持續震蕩，孵育2小時；

用PBS緩沖液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，棄上清；

加入1ml?Tris緩沖液(0.1M，0.1％BSA)，混勻，室溫，置于搖床上持續震蕩，孵育2小時；

加入1ml?PBS緩沖液(PH5.5，0.05％Tween)，靜置2分鐘，棄上清；重復3次，加入1ml?PBS緩沖液(PH5.5)，棄上清，重復3次。棄上清時，試管需置于磁板上；

加入1ml?PBS緩沖液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN₃)，待用；

(4)制備ESAT-6系列標準品；

ESAT-6(全片段重組蛋白，1mg/ml)(購自杭州啟泰生物公司)，PBS(PH7.4)緩沖液稀釋至1、5、50、250、1000ng/ml。

4.一種使用權利要求1所述的基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)各取50μL各濃度的ESAT-6標準品于EP管中，另取1支EP管加入50μLPBS(PH7.4)緩沖液作為陰性對照；

(2)以上各管加入熒光標記的ESAT-6單抗50μL，37℃反應30分鐘；

(3)取完成預處理納米免疫磁珠100μL，用PBS緩沖液(PH7.4)稀釋至1000μL；吸取50μL免疫磁珠，加入所述試管中，37℃反應15分鐘，磁板上靜置2分鐘，棄上清；加入500μLddH₂O，磁板上靜置2分鐘，棄上清，重復該步驟3次；

所述預處理納米免疫磁珠的處理方法為：

制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠(購自武漢哇哇噻納技術開發有限公司北京生物技術研究所)：

1)納米磁珠的預處理：

輕輕混勻磁珠懸浮液，吸取0.01ml懸浮液(25mg/ml)加入1.5ml?EP試管中；再加入0.1ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復上述步驟1次；

加入1ml?0.1M的乙磺酸溶液(pH＝5.0,MES)，重懸磁珠；

2)納米磁珠的活化

將上述EP管置于磁板上，用1mlMES洗滌2次，棄上清；

臨用前配置終濃度為0.1M的MES，其內含EDC和NHS的濃度均為40g/L(加入上述兩種物質后，置于振蕩器上充分混勻15分鐘，待用)。用該液重懸磁珠；

用磁板吸附磁珠，棄上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，棄上清；

3)磁珠與蛋白的鏈接；

在已處理好的磁珠中加入50μL?ESAT-6多克隆抗體(1mg/ml)(Pierece公司)和500μL?PBS(PH5.5)，混勻，室溫，置于搖床上持續震蕩，孵育2小時；

用PBS緩沖液(PH5.5，0.05％Tween)清洗3次，棄上清；

加入1ml?Tris緩沖液(0.1M，0.1％BSA)，混勻，室溫，置于搖床上持續震蕩，孵育2小時；

加入1ml?PBS緩沖液(PH5.5，0.05％Tween)，靜置2分鐘，棄上清；重復3次，加入1ml?PBS緩沖液(PH5.5)，棄上清，重復3次。棄上清時，試管需置于磁板上；

加入1ml?PBS緩沖液(pH＝7.4，0.05％Tween-20，0.1％BSA，0.05NaN₃)，待用；

(4)各管加入100μL?PBS緩沖液(PH7.4)，混勻，用便攜式流動進樣熒光檢測器(為中科院理論物理所制備的樣機，該設備固化為激發光波長為777nm，發射光波長為790nm)進行熒光強度測定；

(5)結果判斷

定性檢測以陰性對照熒光強度值的2倍作為Cutoff值；

定量檢測以熒光發射強度和對應的蛋白標準品濃度進行回歸分析，建立標準曲線，并擬合方程。