[發明專利]檢測鴨2型腺病毒的引物及試劑盒

在審

• 申請號: 201510188768.0
• 申請日: 2015-04-20
• 公開（公告）號: CN105039586A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 招麗嬋;林麗苗;周慶豐;覃健萍;操勝;王占新;曾凡桂
• 申請（專利權）人: 廣東溫氏食品集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 陳雅平

技術領域

本發明涉及動物病原微生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測鴨2型腺病毒的引物及試劑盒。

背景技術

鴨2型腺病毒（DuckAdenovirus2）1977年首次在法國番鴨發現，主要引起15-35天齢番鴨發病死亡，感染鴨只表現為精神萎靡、沉郁、消瘦、軟腳、拉黃白色黏液稀糞，肝臟腫大蒼白彌漫性黃白色針尖樣壞死灶，胰腺白色壞死點，脾臟腫大充血，腎臟腫大充血成黃色條索狀，感染早期有輕度呼吸道癥狀，發病高峰期每天導致1%-1.5%的死亡率，并持續約10天時間總發病死亡率高達15-25%不等。1982年，J.F.BOUQUET首次利用水禽及鴨源細胞分離得到該病毒，當時根據其宿主范圍、臨床癥狀及血清學方法分類該病毒與目前已發現的12個血清型并不相關，推斷為新的鴨腺病毒。鴨2型腺病毒屬于I亞群腺病毒，根據限制性內切酶片段圖譜和核酸序列等分子生物學標準暫未定種，病毒核酸為雙股DNA。

鴨2型腺病毒感染近年來在廣東、浙江、福建等地番鴨、櫻桃谷鴨養殖場頻頻爆發直接導致發病死亡率高達10%-30%不等，給我國養鴨業造成較大的經濟損失。本研究者為國內首次從發病死亡番鴨中分離獲得鴨2型腺病毒，同時通過分子生物學手段獲取了該病毒部分基因組序列。因此建立一種準確、快速、靈敏的檢測方法對其進行監控，保證養鴨業健康發展十分必要。近年來，實時熒光定量PCR以其特異性強、靈敏度高，可定量，有效解決PCR污染及自動化程度高等優點，在醫學、微生物學及動植物檢驗檢疫方面得到了廣泛應用。暫未見鴨2型腺病毒的相關研究及報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種檢測鴨2型腺病毒的引物；另外提供一種檢測鴨2型腺病毒的試劑盒。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一種檢測鴨腺病毒2型的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示。

上游引物F：TGTTCCGGAATGTAACCTGTTTAA（SEQIDNO:1）；

上游引物R：CATCGCGCTCGTAGTCGT（SEQIDNO:2）。

一種檢測鴨腺病毒2型的熒光定量引物組，上述的檢測鴨腺病毒2型的引物，以及SEQIDNO:3所示的核苷酸序列構成的探針，SEQIDNO:3所示的核苷酸序列5’端標記有發光的報告熒光基團，3’端標記有不發光的淬滅基團Eclipse。

探針P：CTCCGAGAACCGAGGTGCCGC（SEQIDNO:3）。

優選地，上述檢測鴨腺病毒2型的熒光定量引物組中，所述報告熒光基團為FAM（羥基熒光素）。

一種檢測鴨腺病毒2型的熒光定量試劑盒，以上所述的檢測鴨腺病毒2型的熒光定量引物組。

優選地，上述檢測鴨腺病毒2型的熒光定量試劑盒中，還包括以下組分：PCR反應緩沖液、Mg²⁺、無菌雙蒸水、dNTP的混合物以及Taq酶。

優選地，上述檢測鴨腺病毒2型的熒光定量試劑盒中，還包括標準陽性對照品，為插入了鴨2型腺病毒52K基因SEQIDNO:4所示核苷酸片段的pMD18-T質粒。該pMD18-T質粒可在大腸桿菌E.coliTOP10中增殖，3.55×10¹⁰拷貝數/μL，-20℃保存。該鴨2型腺病毒52K基因SEQIDNO:4所示核苷酸片段是本研究通過設計引物特異性擴增測序獲得的。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明根據對NCBI登陸的鴨2型腺病毒（GenBank登錄號為KJ469653.1）及其他I亞群禽腺病毒52K基因序列信息，經比對分析，設計特異性檢測鴨2型腺病毒的引物探針，建立了熒光定量PCR方法，提供了一種鴨2型腺病毒檢測試劑盒，可對鴨2型腺病毒感染進行快速鑒別診斷，節省了時間和成本，提高了準確性。

本發明的鴨2型腺病毒Tagman實時熒光定量PCR檢測試劑盒在鴨2型腺病毒病原檢測中重復性好，定量準確，樣品檢測僅需要2-3小時即可完成，使用試劑盒開展疫病診斷可大大縮短檢測時間，易于定量、假陽性低等特點，有利于規?；妥詣踊瘷z測分析。

附圖說明

圖1：TaqMan熒光定量PCR曲線，其中a為標準陽性模板，b為標準曲線分析質?？截悢蹬cCt值的相關性，橫坐標代表質粒模板拷貝數（x），縱坐標為Ct值；

圖2：本發明引物及探針的特異性檢測實驗結果；

圖3：本發明引物及探針的靈敏度檢測實驗結果；

圖4：本發明引物及探針的重復性檢測實驗結果。