[發(fā)明專利]一種具有蛋白標(biāo)簽定位的光激活熒光探針及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510161285.1
• 申請(qǐng)日: 2015-04-07
• 公開（公告）號(hào): CN104745177A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林秋寧;宋江江;包春燕;朱麟勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C09K11/06
• 分類號(hào): C09K11/06;C07D493/10;A61K49/00
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責(zé)任公司 31203
• 代理人: 李鴻儒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有蛋白標(biāo)簽定位的光激活熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

在生物學(xué)研究領(lǐng)域，光學(xué)顯微鏡是一種被廣泛使用和不可或缺的成像工具。與其他顯微鏡相比，光學(xué)顯微鏡，尤其是熒光顯微鏡有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：非侵害性(允許對(duì)活細(xì)胞、組織和有機(jī)體的觀察)和高精確性(通過熒光標(biāo)記，對(duì)靶向分子進(jìn)行精確特定觀察)。我們知道，常規(guī)的光學(xué)顯微鏡如共聚焦熒光顯微鏡由于光波的衍射作用，也就是受衍射極限的限制，其極限分辨率始終沒能突破200nm。為了研究胞內(nèi)分子納米尺度的結(jié)構(gòu)特征，提高光學(xué)顯微鏡分辨率成為了科學(xué)家們的研究方向。近年來，科學(xué)家們發(fā)明和發(fā)展了許多超分辨熒光顯微術(shù)以克服衍射極限的屏障。例如哈佛大學(xué)莊小威教授提出的隨機(jī)重建光學(xué)顯微術(shù)(STORM)(Rust,M.J.,Bates,M.,and?Zhuang,X.(2006).Nat.Methods3,793-795)，在單分子熒光技術(shù)基礎(chǔ)上，借助光活化、光學(xué)重建等手段成功突破了衍射極限，達(dá)到了納米尺度的熒光成像。還有Eric?Betzig提出的光激活定位顯微鏡(PALM)(Betzig?E,Patterson?GH,Sougrat?R,Lindwasser?OW,Olenych?S,Bonifacino?JS,Davidson?MW,Lippincott-Schwartz?J,Hess?HF(2006).Science?313(5793):1642–1645),借助光激活熒光蛋白也成功的達(dá)到了納米尺度的熒光成像。然而超分辨熒光成像無論是PALM還是STORM技術(shù)，其核心樞紐都是具有光調(diào)控發(fā)光特征的熒光探針，光調(diào)控發(fā)光主要是指光激活和光轉(zhuǎn)換(可逆和不可逆)。目前，適用于在超分辨成像的探針主要是：1)具有光調(diào)控發(fā)光的熒光蛋白；2)具有光調(diào)控功能的小分子染料。前者通常是通過基因融合技術(shù)在生物體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)熒光蛋白實(shí)現(xiàn)可視化，后者主要是依賴于化學(xué)合成。

由于光調(diào)控發(fā)光的熒光蛋白具有非常高的特異性，近些年來被廣泛地開發(fā)和應(yīng)用于超分辨成像領(lǐng)域。比如有由“暗”變“亮”的不可逆轉(zhuǎn)變光激活熒光蛋白(PAFPs)：光激活綠色熒光蛋白(PA-GFP)，紅色熒光蛋白衍生物(PAmRFP1和PAmCHerry1)等；熒光ON/OFF的可逆轉(zhuǎn)換PAFPs：FP595，Dronpa及其突變體Padron等；熒光顏色不可逆轉(zhuǎn)變PAFPs：Kaede，Monomeric?Eos，KiKGR等。雖然這些年新的熒光蛋白層出不窮，但是熒光蛋白還是有一些明顯的缺陷，比如熒光蛋白的尺寸相對(duì)較大，可能會(huì)干擾被標(biāo)記蛋白的生理功能，同時(shí)影響熒光定位的精確性，此外，熒光蛋白的熒光量子產(chǎn)率較低，光穩(wěn)定性較差，即使最亮的顏色不可逆轉(zhuǎn)變PAFPs如Eos都要比一些小分子熒光染料的亮度低。

與上述熒光蛋白相比，光調(diào)控小分子熒光染料展現(xiàn)了許多優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)良的光物理特性，尺寸較小不影響熒光定位的空間精度，合成簡(jiǎn)單，顏色種類多等等。理論上說，任何合適的具有光轉(zhuǎn)換特性的熒光團(tuán)都能被用于超分辨熒光成像領(lǐng)域。但當(dāng)前，在超分辨熒光成像領(lǐng)域得到應(yīng)用的小分子熒光染料主要是光調(diào)控發(fā)光的Cy染料(Cy2-Cy7)、具有光致變色的羅丹明衍生物染料和Alexa?Fluor系列染料。在隨機(jī)超分辨成像中，光可逆轉(zhuǎn)換的Cy染料的應(yīng)用最廣。莊小威研究組利用Cy3-Cy5探針對(duì)通過免疫熒光標(biāo)記方法實(shí)現(xiàn)了隨機(jī)光學(xué)重建超分辨成像。但是，該探針體系仍然有許多的不足值得我們注意：1)通過免疫熒光標(biāo)記方法，Cy3-Cy5探針對(duì)標(biāo)記在抗體上，而抗體并不具有跨膜能力，因此只能應(yīng)用于固定細(xì)胞或者細(xì)胞膜表面，不能用于活細(xì)胞成像；2)Cy3-Cy5探針對(duì)光轉(zhuǎn)換機(jī)制還不清楚，且對(duì)周圍的環(huán)境要求很苛刻，因?yàn)槠涔廪D(zhuǎn)換需要在還原的條件下才能進(jìn)行，這就需要添加含巰基的還原劑和除氧劑；3)操作難度比較大，因?yàn)镃y3和Cy5的距離要滿足1-3nm才可完成配對(duì)。此外，相比熒光蛋白，小分子熒光染料雖然有眾多優(yōu)勢(shì)，但也存在一些缺陷：1)其為化學(xué)合成，外源加入到細(xì)胞中，其特異性標(biāo)記程度比較低，往往需要大量洗滌且熒光背景較高；2)許多小分子熒光探針(如磺酸化的Cy染料)沒有自發(fā)跨膜能力，這限制其只能應(yīng)用于固定細(xì)胞或者細(xì)胞膜表面。