[發(fā)明專利]基于DNA Barcoding的六種鯉科魚類及其生肉制品的鑒別方法及鑒別試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510159000.0
• 申請(qǐng)日: 2015-04-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104774938A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡原;趙生國(guó);鄭王山;郭永博;權(quán)金強(qiáng);李永青;汪文強(qiáng);邊琳鶴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

背景技術(shù)

DNA條形碼(DNA?Barcoding)是通過(guò)對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。這個(gè)概念的原理與零售業(yè)中對(duì)商品進(jìn)行辨認(rèn)的商品條形碼是一樣的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，DNA條形碼技術(shù)的關(guān)鍵就是對(duì)一個(gè)或一些相關(guān)基因進(jìn)行大范圍的掃描，進(jìn)而來(lái)鑒定某個(gè)未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種(Hebert?et?al.，2003a；Hebert?et?al.，2003b；Hebert?et?al.，2004)。

自從提出DNA條形碼的概念以來(lái)，這種新興分類學(xué)技術(shù)已經(jīng)引起了越來(lái)越多的生物學(xué)家的關(guān)注。DNA條形碼技術(shù)是分類學(xué)中輔助物種鑒定的新技術(shù)，它代表了生物分類學(xué)研究的一個(gè)新方向(肖金花等，2004)，因此它在生態(tài)、環(huán)境、食品等諸多領(lǐng)域都將會(huì)有廣泛的應(yīng)用(Janzen，2004)。

DNA條形碼技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)有很多，其中包括：(1)鑒定不依賴形態(tài)特征，只需提供物種的DNA即可鑒定，一旦某一生物DNA條碼數(shù)據(jù)庫(kù)建立起來(lái)，條形碼技術(shù)能夠快速的從部分零散組織中鑒定到種的水平。(2)對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作技能要求不高，鑒定過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化、快速、準(zhǔn)確。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，可使各種物種的辨認(rèn)成為可能，如瀕危物種或常見(jiàn)種、土著物種或入侵種等，也使更多的無(wú)分類學(xué)專業(yè)知識(shí)的人能夠準(zhǔn)確的辨認(rèn)出某個(gè)物種。

DNA條形碼技術(shù)的主要流程包括：提取待檢測(cè)物種DNA、設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序及序列比對(duì)，結(jié)果分析。其中最關(guān)鍵的是DNA條形碼理想序列的確定和標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。

已有研究表明，編碼線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I(CO?I)基因是許多魚類(Savolainen?et?al.，2005；Ward?et?al.，2005)、昆蟲(Smith?et?al.，2005；Ahrenset?al.，2007；Elias?et?al.，2007；張媛等，2011)和鳥類(Hebert?et?al.，2004；Tavares?and?Baker，2008)等動(dòng)物分類與鑒別的理想DNA條形碼。

鯉科是世界現(xiàn)生淡水魚類中最大的科，也是分布區(qū)域最廣的一個(gè)科，其中亞洲地區(qū)鯉科魚類的物種分化最為顯著，而東亞地區(qū)是亞洲鯉科魚類多樣性最為豐富的地區(qū)之一。

在長(zhǎng)期的歷史發(fā)展中，中國(guó)人賦予鯉魚以豐富的文化內(nèi)涵。在中國(guó)傳統(tǒng)飲食文化中就有“無(wú)鯉不成席”的說(shuō)法。與中國(guó)老百姓生活息息相關(guān)的常見(jiàn)的鯉科魚類除了鯉魚還有青魚、團(tuán)頭魴、草魚、白鰱、鯽魚等，為此迫切需要針對(duì)上述魚肉制品，特別是生肉制品，開(kāi)發(fā)一種準(zhǔn)確、高效的鑒定方法，為魚肉制品的溯源和安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

另外，近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，生態(tài)問(wèn)題日益突出，為外來(lái)物種的入侵提供了便利條件，給當(dāng)?shù)佤~類開(kāi)發(fā)和保護(hù)帶來(lái)隱憂。而鯉科魚類作為我國(guó)水生環(huán)境的指標(biāo)生物，不僅可作為水體凈化指標(biāo)，還可以作為外來(lái)物種入侵檢驗(yàn)指標(biāo)，同時(shí)其多樣性指標(biāo)也可以反映其生境狀態(tài)。

如何快速有效的識(shí)別魚類，特別是鯉科魚類，成為迫切需要解決的問(wèn)題。但是，由于傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)目前得不到足夠的重視，形態(tài)分類的專業(yè)人員逐步減少，影響了魚類資源保?護(hù)以及生境研究等工作。

向燕等在《清水江鯉魚線粒體COI基因序列變異及遺傳多樣性》一文中對(duì)清水江鯉魚線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COI)基因序列的變異及遺傳多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明清水江鯉魚COI序列變異較豐富，但其遺傳多樣性較低。結(jié)果分析顯示，流域環(huán)境變化和生境破碎化導(dǎo)致采樣水域鯉魚的特有性適應(yīng)和基因交流頻繁或許是形成現(xiàn)狀的重要影響因素。

王茜等《四種常見(jiàn)鯉科魚類DNA條形碼的研究》、彭居俐《東亞特有鯉科類群的DNA條形碼研究及其系統(tǒng)發(fā)育分析》中均是采用的線粒體CO1基因靠近5’末端的一段長(zhǎng)度為814-816bp的序列，該序列在鲌屬、鲌亞科和東亞特有鯉科魚類中，能夠有效的區(qū)分各物種。

雖然使用上述方法可用于鑒別部分鯉科魚類，但是該方法存在需擴(kuò)增和測(cè)序的特異性DNA片段長(zhǎng)，測(cè)序成本高且結(jié)果分析復(fù)雜等問(wèn)題，不利于上述常見(jiàn)鯉科魚類及其生肉制品鑒定方法的推廣以及物種保護(hù)、生境研究等科研工作的開(kāi)展。

發(fā)明內(nèi)容