[發明專利]用于檢測支原體抗體的組合物及其應用

有效

• 申請號: 201510157998.0
• 申請日: 2015-04-03
• 公開（公告）號: CN104730256A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 熊祺琰;邵國青;王佳;劉茂軍;馮志新;韋艷娜;馬慶紅;華利忠;倪博
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 袁靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及用于檢測支原體抗體的組合物及其應用。

背景技術

豬鼻支原體(Mycoplasma?hyorhinis)，屬于支原體科(Mycoplasmataceae)支原體屬(Mycoplasma)成員，最早由Carler和Mckay于1953年從傳染性萎縮性鼻炎豬的鼻腔內分離獲得，故定名為豬鼻支原體。豬鼻支原體是臨床豬場中常見病原菌，通常由母豬或大豬傳染給小豬，通常通過飛沫或直接接觸由上呼吸道感染傳播。豬只一旦感染，該支原體在上呼吸道迅速傳播并且能從感染豬的肺臟和鼻咽管中分離到，而后可經呼吸道移行至全身。豬鼻支原體能夠引起豬多發性漿膜炎、關節炎、中耳炎、肺炎等病癥。其臨床感染率在不同國家地區普遍可達60-70％以上。同時豬鼻支原體亦可與其他病原菌形成混合感染，加重疾病的發生率和嚴重程度。近年來的研究發現豬鼻支原體屬于人獸共患性疾病病原，其感染與多種人類癌癥，包括胃癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等有明顯的相關性。豬鼻支原體可誘導正常細胞發生惡性轉化或誘導腫瘤細胞惡性程度增加，導致這一轉化現象發生的機制尚不十分清楚，可能包括誘導遺傳不穩定性，如染色體異常、突變率增加；誘導宿主代謝過程的改變；誘導多種腫瘤相關基因的表達改變等。此外豬鼻支原體也是細胞培養中引起培養污染的最常見支原體之一，污染后可導致細胞形態、生長狀態、增殖周期等受到影響。

目前報道用于檢測豬鼻支原體病原(抗原)或感染后抗體的方法主要包括聚合酶鏈式反應(PCR)、原位雜交、免疫組織化學、酶連免疫吸附試驗(ELISA)方法。PCR技術用于檢測病原，具有特異性強、靈敏度高等特點，因此PCR技術用于豬鼻支原體的檢測發展較為迅速，是目前最常用的方法。但PCR技術通常以鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液或組織為待檢樣本，其中鼻拭子樣本的檢出率較低，適合用于群體感染情況的判定，對于個體而言，易出現假陰性的結果；支氣管肺泡灌洗液及組織樣本的采集通常需要剖殺動物獲取，臨床上很難操作。原位雜交和免疫組織化學方法用于檢測抗原，可以對體內抗原實現組織定位，但同樣需要剖殺動物取組織樣本才可進行，操作技術要求高、且難以實現量化，臨床上很少使用。ELISA方法具有準確、簡便、易于推廣等優點，可用于抗原或抗體檢測，是微生物感染檢測的首選方法。有報道利用制備的特異性單抗建立了雙抗體夾心ELISA法用于檢測豬鼻支原體抗原，但以抗原為檢測對象同樣面臨前述三個方法存在的應用局限；在抗體檢測方面，通常可利用全菌蛋白為檢測抗原，但由于不同支原體之間存在很多交叉抗原，檢測時與宿主中感染的其他支原體產生交叉反應導致假陽性結果。豬群除了豬鼻支原體外，還可能感染另外幾種支原體，包括豬肺炎支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體，其中又以豬肺炎支原體感染嚴重程度最重，這些支原體的抗體都可能干擾豬鼻支原體抗體的檢測和判斷，因此必須從豬鼻支原體全蛋白中篩選高特異性的合適蛋白作為檢測抗原。近期有文獻報道利用豬鼻支原體P37蛋白為包被抗原初步建立ELISA方法檢測血清抗體，但實際上通過序列比對可發現P37蛋白與多種其他豬源支原體，尤其是豬肺炎支原體有明顯交叉表位，會導致產生嚴重的假陽性檢測結果。故而，建立豬鼻支原體抗體檢測ELISA方法的關鍵在于尋找豬鼻支原體特異性的抗原蛋白。

發明內容

本發明的目的是提供用于檢測支原體抗體的組合物，可以特異性的檢測豬鼻支原體抗體。

本發明的另一目的是提供所述組合物在檢測支原體抗體的試劑盒或金標試紙中的應用。

本發明的目的采用如下技術方案實現。

用于檢測支原體抗體的組合物，含有7種多肽，所述各多肽的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6和SEQ?ID?NO:7所示。

在本發明中，所述支原體抗體為豬鼻支原體抗體。

由于豬鼻支原體不同菌株vlp家族Ⅲ區重復肽段序列之間存在一定變異，因此，優選的技術方案中，所述7種多肽中的一種或兩種以上取代、插入或缺失1-3個氨基酸殘基。多肽與載體蛋白進行偶聯，得到多肽與載體蛋白的偶聯物。

優選的技術方案中，所述7種多肽中的一種或兩種以上與載體蛋白進行偶聯，以克服長度較短的多肽直接包被酶標板后，受到空間位阻影響表位暴露不好，反應效率不夠高的缺點。

優選的技術方案中，所述載體蛋白為鑰孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛甲狀腺球蛋白(THY)。