[發(fā)明專利]16SrRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測引物、檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510147249.X
• 申請日: 2015-03-31
• 公開（公告）號: CN104789659B
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發(fā)明（設計）人: 劉玉慶;齊靜;楊煒華;黃保華;駱延波;胡明;李璐璐;張慶
• 申請（專利權）人: 山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司37105
• 代理人: 韓百翠

1.一種16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測引物，其特征是，由一對外引物F3、B3，一對內引物FIP、BIP和一個環(huán)引物L組成，其核苷酸序列分別如下：

外引物F3：5’-CGATGCCCTCACCTCCAT-3’；

外引物B3：5’-GCCTTTTTTACATCGCCCG-3’；

內引物FIP：5’-ATTCCTCAGTCAGGATGCGCCGGCCTCAAAAAAATACCGCG-3’；

內引物BIP：5’-CCAAACAGACCGTAGAGGCTGCCAGCCTTGAGCGATTCCG-3’；

環(huán)引物L：5’-GCTGCATGGAATTTGCGGGG-3’。

2.一種含有權利要求1所述引物的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測試劑盒。

3.如權利要求2所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測試劑盒，其特征是，所述外引物與內引物的摩爾比為1:8，外引物與環(huán)引物的摩爾比為1:4。

4.如權利要求2所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測試劑盒，其特征是，它包括若干個裝有反應液的LAMP反應管，其中，每25μL反應液中含有：12.5μL 2×等溫反應緩沖液、1.0μL Bst DNA聚合酶、40pmol內引物FIP、40pmol內引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol環(huán)引物L、待檢細菌基因組DNA若干，余量為滅菌雙蒸水。

5.如權利要求4所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測試劑盒，其特征是，所述2×等溫反應緩沖液中含有40mM pH為8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO₄、20mM(NH₄)₂SO₄、0.2wt％Tween20、1.6M甜菜堿、2.8mM dNTP。

6.如權利要求5所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測試劑盒，其特征是，所述Bst DNA聚合酶的活性單位為8U/μL。

7.如權利要求5或6所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測試劑盒，其特征是，所述25μL反應液中還含有1μL的鈣黃綠素。

8.一種16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測方法，其特征是，

(1)提取待檢細菌基因組的DNA；

(2)使用權利要求6所述的LAMP檢測試劑盒進行檢測：將待檢細菌基因組DNA加入LAMP反應管的反應液內，混勻，同時設陰性對照和陽性對照，陽性對照中加入反應液內的為含有rmtB基因的基因組DNA，陰性對照中加入反應液內的為滅菌雙蒸水，將LAMP反應管置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為：63℃水浴恒溫反應45-60min；

(3)結果判斷：反應結束后，憑借肉眼可見的白色沉淀判定結果，有白色沉淀為陽性，清亮為陰性；

所述方法用于非診斷和治療目的。

9.一種16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測方法，其特征是，

(1)提取待檢細菌基因組的DNA；

(2)使用權利要求7所述的LAMP檢測試劑盒進行檢測：將待檢細菌基因組DNA加入LAMP反應管的反應液內，混勻，同時設陰性對照和陽性對照，陽性對照中加入反應液內的為含有rmtB基因的基因組DNA，陰性對照中加入反應液內的為滅菌雙蒸水，將LAMP反應管置水浴鍋中進行擴增，擴增條件為：63℃水浴恒溫反應45-60min；

(3)結果判斷：反應結束后，憑借反應液的顏色判定結果，綠色的為陽性，仍保持橙色的為陰性；

所述方法用于非診斷和治療目的。

10.如權利要求8或9所述的16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP檢測方法，其特征是，所述步驟(1)提取待檢細菌基因組DNA包括以下步驟：將待檢的細菌菌株過夜培養(yǎng)后，取1mL的菌液12000rpm離心2min，徹底棄上清，取沉淀加入1mL無菌雙蒸水，沸水浴10min，12000rpm離心2min，取上清至新離心管中，測定并調整DNA濃度為300-500ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->