[發(fā)明專利]細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法

有效

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• 申請日: 2015-03-27
• 公開（公告）號: CN104792750B
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧永鍵;丁彥青;馬麗麗;羅揚(yáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/20
• 分類號: C12Q1/20
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司44224
• 代理人: 李海恬,萬志香

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞研究領(lǐng)域，尤其是涉及一種細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的在觀察研究因子誘導(dǎo)下細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變主要依靠專門的設(shè)備，如μ-SlideChemotaxis2D/3D。該設(shè)備的基本原理是搭配微量分注器用于兩側(cè)儲(chǔ)液槽中制造出化學(xué)物質(zhì)的線性濃度梯度，此時(shí)培養(yǎng)于儲(chǔ)液槽中間的觀察管道中的細(xì)胞即處于穩(wěn)定的線性濃度梯度培養(yǎng)環(huán)境中，適于分析2D/3D基質(zhì)表面緩慢遷移的細(xì)胞的趨化性反應(yīng)，例如癌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等；其他緩慢遷移的細(xì)胞趨化性試驗(yàn)以及利用顯微視頻進(jìn)行細(xì)胞示蹤的試驗(yàn)等。

雖然μ-SlideChemotaxis2D/3D等設(shè)備能夠證明趨化因子濃度梯度可以改變研究對象運(yùn)動(dòng)方向，但依然存在以下幾個(gè)問題：第一，此設(shè)備并不能很好的限定待研究因子的具體方向；第二，不能夠確切的觀察細(xì)胞內(nèi)部各研究指標(biāo)極性方向的改變；第三，顯微鏡視頻進(jìn)行示蹤是必不可少的，而這對顯微鏡是一種過分的耗損；第四，設(shè)備價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，有必要提供一種能夠方便、直觀的觀察化學(xué)因子作用下細(xì)胞內(nèi)待研究的目標(biāo)物質(zhì)的極性方向變化的細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法。

一種細(xì)胞極性模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

步驟一：使用激光共聚焦培養(yǎng)皿作為細(xì)胞極性模型的研究裝置，圍繞所述激光共聚焦培養(yǎng)皿中間的培養(yǎng)槽將所述激光共聚焦培養(yǎng)皿分成至少兩個(gè)極性控制區(qū)；

步驟二：圍繞所述培養(yǎng)槽在所述極性控制區(qū)加入培養(yǎng)基，至少有兩個(gè)極性控制區(qū)內(nèi)的培養(yǎng)基存在待研究的化學(xué)因子濃度差，其中，所述培養(yǎng)基為固體或半固體培養(yǎng)基；

步驟三：向所述培養(yǎng)槽內(nèi)加入細(xì)胞懸浮液，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，加入的細(xì)胞懸浮液的高度大于所述培養(yǎng)槽的深度且小于所述培養(yǎng)槽的深度與所述培養(yǎng)基的厚度之和；

步驟四：細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，針對細(xì)胞中待研究的目標(biāo)物質(zhì)對培養(yǎng)槽內(nèi)的細(xì)胞使用免疫熒光法染色，并采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，以研究所述目標(biāo)物質(zhì)對所述化學(xué)因子的極性。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟一中，在對所述激光共聚焦培養(yǎng)皿劃分極性控制區(qū)時(shí)，是圍繞所述培養(yǎng)槽將所述激光共聚焦培養(yǎng)皿平均分成至少兩個(gè)極性控制區(qū)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟二中，在圍繞所述培養(yǎng)槽在所述極性控制區(qū)加入培養(yǎng)基時(shí)，首先在相應(yīng)的極性控制區(qū)加入不含有所述化學(xué)因子的空白培養(yǎng)基，待空白培養(yǎng)基固化或半固化后，再在其他極性控制區(qū)依次加入含有所述化學(xué)因子的培養(yǎng)基，進(jìn)行固化或半固化處理，并使至少有兩個(gè)極性控制區(qū)內(nèi)的培養(yǎng)基中所述化學(xué)因子存在濃度差。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟四中，所述針對細(xì)胞中待研究的目標(biāo)物質(zhì)對培養(yǎng)槽內(nèi)的細(xì)胞使用免疫熒光法染色包括：

對所述細(xì)胞依次進(jìn)行固定處理、透膜處理及封閉處理；

加入與所述目標(biāo)物質(zhì)對應(yīng)的抗體溶液進(jìn)行孵育處理；

加入與所述抗體對應(yīng)的熒光染料標(biāo)記的二抗進(jìn)行標(biāo)記處理；

對標(biāo)記處理后的樣品使用染色液染色處理。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟四中，所述采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照觀察包括在所述培養(yǎng)槽中選取圓形的觀察范圍的步驟，選取的所述觀察范圍需排除因細(xì)胞與所述化學(xué)因子的距離而引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述極性控制區(qū)有四個(gè)，其中三個(gè)所述極性控制區(qū)加入空白培養(yǎng)基，其中一所述極性控制區(qū)加入含有所述化學(xué)因子的培養(yǎng)基，所述圓形的觀察范圍的邊界與含有所述化學(xué)因子的培養(yǎng)基的內(nèi)側(cè)邊緣相切，且與該培養(yǎng)基兩側(cè)的極性控制區(qū)在所述培養(yǎng)槽內(nèi)的延伸邊界相切。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟四中，所述研究細(xì)胞中的目標(biāo)物質(zhì)對所述化學(xué)因子的極性包括統(tǒng)計(jì)所述目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞數(shù)目占所述觀察視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)目的百分比。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，在統(tǒng)計(jì)所述百分比時(shí)，是以相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞核中心點(diǎn)為圓心，細(xì)胞最長軸作為直徑畫圓，得到的圓形區(qū)域即代表該細(xì)胞，然后根據(jù)圓形區(qū)域代表的細(xì)胞中所述目標(biāo)物質(zhì)的朝向性判斷是否為所述目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述根據(jù)圓形區(qū)域代表的細(xì)胞中所述目標(biāo)物質(zhì)的朝向性判斷是否為所述目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞是：若朝向含有所述化學(xué)因子的極性控制區(qū)的所述目標(biāo)物質(zhì)的表達(dá)量大于其它方向上的表達(dá)量，并且在該圓形區(qū)域內(nèi)，所述目標(biāo)物質(zhì)的表達(dá)量至少有二分之一位于朝向含有該化學(xué)因子的極性控制區(qū)的圓心角為120°的扇形區(qū)域中，則判斷為目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生極化的細(xì)胞。