[發明專利]葡激酶衍生體在制備降血脂藥物中的應用

有效

• 申請號: 201510130693.0
• 申請日: 2015-03-24
• 公開（公告）號: CN104707133A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 徐東剛;王旻;付文亮;王園園;鄒民吉;夏文戎;毛金武
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: A61K38/48
• 分類號: A61K38/48;A61K47/48;A61P3/06;A61P29/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 張文寶

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及葡激酶衍生體(SAK-HV)在制備降血脂藥物中的應用。

背景技術

葡激酶(staphylokinase?SAK)是由金黃色葡萄球菌分泌的一種含有136個氨基酸殘基的胞外蛋白質。葡激酶在本世紀四十年代末被發現，并在五十年代至六十年代發現其具有纖溶作用。

中國專利文獻(CN1850976B)中公開了一種葡激酶衍生體(SAK-HV)(其氨基酸序列在文獻中權利要求1中所示)并且在文獻(Min?Wang,Yuanyuan?Wang,et?al.Construction?and?characterization?of?a?novel?staphylokinase?variant?with?thrombin-inhibitory?activity.Biotechnol?Lett(2009)31:1923–1927)中也進行了公開。上述公開的葡激酶衍生體(SAK-HV)是具有多功能結構域的融合蛋白。

目前降脂類藥物主要包括HMG-CoA還原酶抑制劑，膽酸螯合劑，纖維酸類，煙酸及其衍生物，中藥成分如枸杞多糖、茶葉多糖、黃連素等。目前臨床應用最廣泛的降脂藥物為他汀類藥物，其作用機理為抑制HMG-CoA還原酶，他汀藥物的治療周期一般為6-8周。

發明內容

本發明的目的在于提供葡激酶衍生體(SAK-HV)在制備降血脂藥物中的應用。

所述葡激酶衍生體，其氨基酸序列為中國專利文獻(CN1850976B)中權利要求1所述的氨基酸序列。

一種降血脂組合物，包含權利上述葡激酶衍生體。

所述葡激酶衍生體的制備方法為：培養含有葡激酶衍生體基因序列重組表達載體的工程菌，通過破碎菌體分離上清經過純化后獲得葡激酶衍生體蛋白液，將純化的葡激酶衍生體中加入賦形劑，4℃保存；再加入凍干保護劑，冷凍干燥。

所述賦形劑為海藻糖。

所述保護劑為甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、乳糖、氯化鈉、甘氨酸中的一種以上。

其中，將SAK-HV的基因序列重組構建到表達載體中，轉化宿主菌。所用重組表達載體可為pBV220、pET17b、pET15a或pET28a。可使用的表達宿主菌為E.coliBL21、E.coliDH5α、E.coliHB101、E.coliJM109或E.coliJM103

具體的，SAK-HV粉劑的制備方法為：

利用基因重組技術將SAK-HV蛋白的基因序列構建到表達載體中，進一步轉化宿主菌。通過篩選獲得高表達，高活性的工程菌株。從轉化好的菌種平板上挑取單菌落在無菌環境下接種于3ml含氨卞青霉素(25μg/ml)的LB培養基的試管中，25～30℃振蕩培養過夜制成一級種子液。一級種子液于無菌環境下按0.1:1000的比例接種于2000ml含氨卞青霉素(25μg/ml)的LB培養基中，25～30℃振蕩培養過夜制成二級種子液。二級種子液接種于發酵罐中，發酵培養，富集菌體，通過調節誘導過程中的不同PH值，溶氧量，誘導溫度等條件選擇最佳的發酵條件，發酵結束后，離心收菌，稱重并取菌體破碎進行SDS-PAGE檢測SAK-HV表達水平。經過發酵后富集工程菌，獲得的SAK-HV表達水平可達45％以上。菌體在冰浴中超聲破碎，離心，收集上清進行離子交換層析分離及凝膠過濾分離通過SDS-PAGE，HPLC檢測蛋白純度，純度可達95％以上。選擇不同濃度的凍干保護劑，包括甘露醇、右旋糖酐、蔗糖和甘氨酸等組成不同濃度的單一和復合配方，冷凍干燥后檢測凍干樣品的活性和成型的變化，經過37℃加速實驗后，檢測其活性和成型狀況的改變，確定SAK-HV蛋白粉劑制備的主要成分。

上述降血脂組合物，可通過靜脈、皮下或口服給藥。

將上述降血脂組合物復溶后使用生理鹽水稀釋至0.005～0.5mg/ml靜脈注射，注射周期為14天，每天注射一次連續注射14天；在小鼠上的用量為0.05mg/kg～5mg/kg，鵪鶉上的用量為0.01mg/kg～5mg/kg。