[發明專利]適于在玉米中表達的優化α?半乳糖苷酶基因aga?F75及其應用

有效

• 申請號: 201510098545.5
• 申請日: 2015-03-06
• 公開（公告）號: CN104805101B
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 姚斌;楊培龍;張宇宏;楊文霞;孟昆;袁建華;陳茹梅;孟慶長;張偉;周曉今
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/40;C12N15/82;A01H5/10;A23K10/30
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及適于在玉米中表達的優化α-半乳糖苷酶基因aga-F75及其應用。

背景技術

豆粕和其它豆類餅粕作為最主要的蛋白原料在動物飼料中廣泛使用，主要是因為它們的蛋白含量較高，而且來源比較廣。然而由于這些豆類餅粕中通常含有許多抗營養因子而限制了它們在飼料中應用的比例。其中脹氣因子的大豆中低聚糖主要是α-半乳糖苷之類的寡聚糖。α-半乳糖苷是由一個蔗糖單位(果糖-葡萄糖)與多個半乳糖單位，以α-1,6-糖苷鍵連接而成的長短不同的一類物質，如棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖等。單胃動物體內缺乏α-半乳糖苷酶而不能分解這些物質。當這些物質經過大腸消化時，會被發酵產生大量氣體，導致動物出現脹氣和腹瀉等不良癥狀。

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)也稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原性D-半乳糖。除此外該酶還可以把α-D-半乳糖基殘基轉移到不同的羥基類衍生物上即轉糖基反應。因此它能水解蜜二糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖，還能水解含有α-半乳糖苷鍵的雜多糖。α-半乳糖苷酶廣泛存在于動物、植物、微生物中，現已篩選出不少產α-半乳糖苷酶活性高的微生物，并進行了廣泛深入的研究，尤其在酶制劑的制備和食品工業的應用方面，已取得很大進展。

現在生產上通常需要添加α-半乳糖苷酶制劑來促進營養物質的消化并消除或減少飼料組成中α-半乳糖苷糖類對營養物質消化的副作用，從而改善動物的生產性能，降低飼料成本。已經利用微生物發酵進行飼α-半乳糖苷酶的產業化生產，并在飼料工業中廣泛應用，但其具有發酵過程耗能高，生產門檻高和成本高等缺點。而利用轉基因植物生產α-半乳糖苷酶能夠很好的解決如上問題，因而是進一步的發展方向，基因工程研究領域的進展使利用植物表達α-半乳糖苷酶用于飼料工業成為可能。

利用轉基因植物生產α-半乳糖苷酶,其優勢在于：1)轉基因植物尤其是轉基因玉米作為主要飼料原料，可以直接飼喂，避免了目前酶制劑的發酵生產和添加過程；2)生產規模不受限制，成本比較低。農作物的生產、運輸、加工和貯藏等各種基礎設施及技術早已具備，轉基因植物高水平表達生產重組蛋白可以通過大規模種植來完成；3)目前初步的研究發現，在植物，尤其是種子中表達的非淀粉多糖酶具有更好的貯存穩定性和抗逆性；4)安全性好，用微生物發酵生產酶制劑，細胞培養過程中污染極其普遍，但在植物表達系統中沒有這種污染。

玉米作為我國最主要的能量飼料糧之一，被稱為“飼料之王”，其用量占配合飼料成份的60-70％。玉米籽粒是動物飼料最主要的成分，與其他飼料作物相比，轉基因玉米作為生物反應器這具有更好的經濟效益和應用前景。隨著畜牧業的發展和新技術的綜合應用，玉米已成為最重要的糧食、飼料和經濟兼用作物。所以，在此新形勢下，加強優質、專用和資源高效飼用型玉米新品種的培育和推廣具有十分重要的現實意義。

來源于Gibberella sp.F75的α-半乳糖苷酶具有較優良的酶學性質，它同時具有很好的蛋白酶抗性，利用該α-半乳糖苷酶可培育具有優良性質的轉基因植物。多種α-半乳糖苷酶資源分離、微生物重組表達的研究已經被報道，但由于大多數酶的蛋白質分子量較大，酶特性不能滿足要求等原因，目前還沒有在植物中重組表達該酶的報道，因此，本發明通過基因改造，載體選擇、組織特異性表達等方式成功進行了玉米中的表達。

發明內容

本發明的目的之一是將來源于Gibberella sp.F75的α-半乳糖苷酶基因aga-F75進行一系列優化獲得能夠在玉米中高效表達、穩定性好的α-半乳糖苷酶基因aga-F75m；

本發明的目的之二是提供在轉基因植物中高效表達優良性質α-半乳糖苷酶的具體方法。利用重組技術將aga-F75m構建到植物表達載體上，利用高效的組織特異性啟動子介導，利用轉基因技術，整合到植物染色體上，通過選擇培養基得到陽性植株。再通過PCR、Southern blot、Western blot及酶活檢測等方法篩選高效表達優良性質的轉基因植株。

為了提高α-半乳糖苷酶基因玉米中的表達效率和穩定性，在不改變α-半乳糖苷酶氨基酸序列的前提下，本發明將來源于Gibberella sp.F75的aga-F75基因(GenBank登錄號FJ392036)進行密碼子優化。經密碼子優化后，各氨基酸對應的密碼子與玉米最適密碼子更加匹配，GC含量由優化前的51.29％提高到優化后的55.82％；密碼子適應指數(Codon Adaptation Index，CAI)由優化前的0.71提高到優化后的0.82。