[發明專利]一種酶納米復合物及其可控自組裝方法和在免疫分析中的應用

在審

• 申請號: 201510097440.8
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號: CN104655833A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 門冬;張治平;張先恩;張婷婷;侯利偉
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;C12N15/63;C12N15/62
• 代理公司: 北京布瑞知識產權代理有限公司 11505
• 代理人: 楊晞

技術領域

本發明涉及免疫分析領域，特別涉及一種酶納米復合物及其可控自組裝方法和復合物在免疫分析中的應用。

背景技術

酶聯免疫分析(Enzyme-Linked?ImmunoSorbent?Assay,ELISA)是臨床、科研中應用廣泛的特異性目標分子分析方法，其主要通過抗原-抗體分子間的特異性識別和酶分子的高效催化來實現對復雜混合物中目標分子的檢測，傳統的ELISA方法，通過在抗體分子上進行酶分子修飾來進行信號輸出，通常是一對抗原抗體復合物對應一個酶分子，檢測范圍在0.1ng/ml-100ng/ml之間。隨著技術的發展，該靈敏度已經不能夠滿足臨床檢測和科學研究中的需求，因此亟需發展新型的高靈敏分析方法。

目前，現有技術為了增加檢測靈敏度，常見的方法是增加修飾的酶分子的數量從而提高檢測靈敏度。主要包括以下幾種方法：

1.層層自組裝生物素化蛋白網絡，例如現有技術“Layer?by?layer?assembly?of?biotinylated?protein?networks?for?signal?amplification”,Chem.Commun.,2013,49,2397，該技術通過多生物素標記的蛋白分子與親和素反復的結合形成大的復合物，從而使生物素增多，結合大量親和素修飾的酶分子，提高免疫分析靈敏度。但是，該方法存在步驟多，檢測時間長，復合物表面酶分子數量不可控等問題，會造成信號不穩定或者批次間操作的差異等問題。

2.酶信號循環放大法，例如現有技術CN?102809648?A公開了一種酶信號循環放大高靈敏免疫檢測方法，該方法主要是通過使用抗HRP的抗體與HRP交聯，兩者間相互結合形成大的酶分子復合物，來提高靈敏度。然而該方法交聯會破壞HRP或抗體的活性，相互結合形成大團復合物后，尺寸、酶分子數量完全不可控，會造成信號輸出不穩定等問題，而且制備過程復雜。

3.納米自組裝法，如現有技術“Seeding-induced?self-assembling?protein?nanowires?dramatically?increase?the?sensitivity?ofimmunoassays”，Nano?Lett.9(6):2246-50.2009；“An?auto-biotinylated?bifunctional?protein?nanowire?for?ultra-sensitive?molecular?biosensing.Biosens?Bioelectron”,26(4):1137-41.2010。納米自組裝方法是通過自組裝的方法將酶分子和特異性結合分子整合在蛋白納米線上，提高最終結合在抗原-抗體復合物上的酶分子數量，提高檢測靈敏度。但是該方法也存在制備不可控的問題，酶分子數量不確定，最終導致信號不穩定，無法應用于定量檢測。且制備過程繁瑣、成本高。

4.納米管、納米顆粒法，在納米材料(如金納米顆粒、碳納米管等)上修飾酶分子和抗體分子，通過提高酶分子數量來提高檢測靈敏度的。但是該方法中修飾過程不可控，會導致蛋白分子功能失活，修飾數量和質量難以控制，批次間重現性差。

發明內容

本發明為了克服現有技術酶分子數量不可控、重現性差、信號不穩定等缺點，提供了一種酶納米復合物及其可控自組裝方法，復合物所含有的酶分子數量基本一致，并且通過調整組裝比例，可以得到具有不同酶分子數量的酶納米復合物。

為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供一種酶納米復合物，包括位于核心層的納米顆粒，位于中間層的生物素及位于外層的親和素修飾的酶；其中所述納米顆粒為由M個相同或同源的亞基通過自組裝形成的球形納米顆粒，每個納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接M個生物素，所述M≥12，且M為整數。

優選的，酶納米復合物(簡稱ENC)中所含有的酶分子數量可通過以下公式進行簡略計算：

X＝n×M-i×n/2

其中，X代表ENC中酶分子的數量，M代表納米顆粒的亞基數目，n代表ENC中所整合的生物素化的蛋白納米顆粒(簡稱NP)的數量，i代表每個NP與相鄰顆粒共享的親和素修飾的酶分子的數量。

優選的，所述納米顆粒為蛋白納米顆粒；本領域技術人員知曉，所述納米顆粒還可為病毒納米顆粒。更為優選的，所述納米顆粒為鐵蛋白納米顆粒，其中，每個鐵蛋白納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接24個生物素。本領域技術人員知曉，鐵蛋白納米顆粒還可為小鐵蛋白，其中，每個小鐵蛋白納米顆粒通過遺傳修飾表面均勻連接12個生物素。