[發(fā)明專利]一種能夠降解*的功能蛋白

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510097222.4
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號: CN104673763B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱宜;袁靜;謝恩;鄭蕾;丁愛中;豆俊峰
• 申請（專利權(quán)）人: 北京師范大學(xué)
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種能夠降解的功能蛋白，其特征在于，該功能蛋白由人蒼白桿菌Ochrobactrumanthropi DW1的菌液經(jīng)過提取與純化得到的，人蒼白桿菌Ochrobactrum anthropi DW1的菌種保藏號為CGMCC NO.8621，其中，從人蒼白桿菌Ochrobactrum anthropi DW1中分離能夠降解的功能蛋白具體方案為：

①向加入198ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基、2.0ml微量金屬液和0.2ml維生素c溶液的培養(yǎng)瓶內(nèi)接種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的菌株人蒼白桿菌Ochrobactrumanthropi DW1；然后用透氣膜密封瓶口，將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)溫度為25～28℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)40d后即可得到擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌液；

②將步驟①中的菌液進(jìn)行超聲波破碎15min；破碎后的菌液在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；

③向由步驟②分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續(xù)進(jìn)行超聲波破碎15min，在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；

④向由步驟③分離出的菌體中加入30ml去離子水，繼續(xù)進(jìn)行超聲波破碎15min，在8000r/min條件下離心15min，分離出菌體和上清液；

⑤合并由步驟②、③和④所收集的上清液，即可得到功能蛋白粗提液；

⑥向由步驟⑤得到的功能蛋白粗提液中加入碾細(xì)的(NH₄)₂SO₄固體至65～70％飽和度，在轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中振蕩1～2h，然后在8000r/min條件下離心15min，分離出沉淀；

⑦將由步驟⑥得到的沉淀溶于5ml pH值為7.0～7.2的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液并裝入透析袋中，將透析袋在pH值為7.0～7.2的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液中透析24h；將透析后的樣品在8000r/min條件下離心15min，分離出上清液；

⑧將由步驟⑦得到的上清液上到已用pH值為7.0～7.2的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液平衡的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱上過濾，采用pH值為7.0～7.2內(nèi)含0.25mol/L氯化鈉的0.05mol/L三羥基甲基氨基甲烷-HCl緩沖液線形洗脫梯度洗脫結(jié)合的功能蛋白，洗脫速度為20ml/h；運(yùn)用容積為10ml的試管收集洗脫液，其中每支試管收集洗脫液5ml；用紫外分光光度計在吸收波長為280nm處檢測洗脫液，收集吸光度大于0.01的洗脫液；測定功能蛋白的活性，選擇活性部分備用；

所述步驟①中誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為：NaNO₃：2.5g/L，NH₄Cl：1.5g·L^-1，KH₂PO₄：1.5g·L^-1，MgCl₂：0.2g·L^-1，CaCl₂·2H₂O：0.15g·L^-1，茚并[1，2，3-cd]芘：0.01g·L^-1；

所述步驟①中微量金屬液的組成為：CoCl₂·6H₂O：35mg·L^-1，CuCl₂：0.25mg·L^-1，H₃BO₃：6.0mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O：30mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O：3.0mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O：2.5mg·L^-1，ZnCl₂：2.5mg·L^-1。