[發(fā)明專利]一種豬腦心肌炎病毒納米PCR檢測試劑盒及其檢驗方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510096905.8
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號: CN104673937A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁萬哲;孫繼國
• 申請（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及豬腦心肌炎病毒的檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬腦心肌炎（Porcine?encephalomyocarditis）是由腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis?virus,?EMCV）引起的一種以腦炎、心肌炎和母豬繁殖障礙為主要特征的人獸共患傳染病。自從1958年從患心肌炎的病豬中分離到EMCV以來，隨后世界上一些養(yǎng)豬國家都曾有該病的發(fā)生、流行以及EMCV感染的報道，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。我國從病原學(xué)和血清學(xué)方面已經(jīng)證實在不少養(yǎng)豬生產(chǎn)地區(qū)的規(guī)模化豬場存在EMCV的感染，對養(yǎng)豬生產(chǎn)潛在的危害受到關(guān)注。

EMCV的檢測方法主要包括傳統(tǒng)的病毒的分離、免疫熒光抗體染色、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等，這些方法在病毒檢測中發(fā)揮了重要作用。其中PCR檢測方法由于操作簡單，靈敏性高、重復(fù)性好等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。但在實際應(yīng)用中，PCR技術(shù)存在諸多局限性，例如對復(fù)雜體系的擴(kuò)增會出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增以及擴(kuò)增效率不夠高等問題。為解決以上問題，尋找可以提高?PCR?特異性和效率的添加劑顯得極其重要。

納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù)，其原理是把粒徑為1nm～100nm的固相納米金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。由于納米材料具有良好的熱傳導(dǎo)性，因此在添加了納米金顆粒的PCR循環(huán)體系中，PCR反應(yīng)會更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，減少了在非目標(biāo)溫度的停留時間，進(jìn)而縮短整個體系達(dá)到溫度平衡所用的時間，減少非特性擴(kuò)增，提高特異性擴(kuò)增產(chǎn)量。因此，目前亟需建立一種能夠快速、特異的檢測豬腦心肌炎病毒的納米PCR檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒能夠快速、特異的檢測豬腦心肌炎病毒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于豬腦心肌炎病毒檢測的納米PCR試劑盒，包括5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP?Mixture、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于所述試劑盒還包括2×NanoPCR?Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ?ID?No.1所示，所述下游引物的序列為SEQ?ID?No.2所示。

引物是根據(jù)GenBank公布的豬腦心肌炎病毒序列，在其3D基因保守序列區(qū)域設(shè)計的一對特異性引物。

優(yōu)選的，2×NanoPCR?Mix由?DNA聚合酶、2×NanoPCR?buffer和dNTP?Mixture組成。

優(yōu)選的，反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。

優(yōu)選的，反轉(zhuǎn)錄引物的序列為SEQ?ID?No.2所示。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括RNA提取試劑：TRIzol?LS?Reagent、氯仿、異丙醇、75%乙醇。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陽性對照。

其中，陽性對照可為將豬腦心肌炎病毒接種BHK-21細(xì)胞后，收集24～48小時細(xì)胞培養(yǎng)物。

本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備檢測待測樣品中是否含有豬腦心肌炎病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

應(yīng)用所述試劑盒檢測待測樣品中是否含有豬腦心肌炎病毒的方法，包括如下步驟：

1、病毒RNA的提取

（1）將250?μL經(jīng)過預(yù)處理的待測樣品加入750?μL?TRIzol?LS?Reagent中，劇烈振蕩2?min，室溫放置5?min。加入250?μL氯仿，劇烈振蕩1min，室溫放置5min后，4℃?12,000?rpm離心15?min，將上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管。（2）加入與水相等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置15?min，4℃?12,000?rpm離心15?min，輕輕倒去上清，然后加入DEPC處理的75%乙醇700～800μL，4℃?12,000?rpm離心5?min，棄上清。（3）將沉淀自然風(fēng)干或于50℃干燥箱中晾干，用適量無核酸酶水充分溶解后立即進(jìn)行PCR或貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

待測樣品可為腦、心臟、淋巴結(jié)。其中，待測樣品預(yù)處理的方法為：將待測樣品剪碎后，按照1:5的質(zhì)量體積比加入生理鹽水并研磨均勻，3000～5000rpm離心5～10分鐘后取上清，之后再進(jìn)行RNA的提取。

2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

??取上述步驟所得的病毒總RNA?11?μL，加入2?μL?10μM的反轉(zhuǎn)錄引物（SEQ?ID?No.2），4?μL?5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.5?μL反轉(zhuǎn)錄酶、0.5?μL?RNA酶抑制劑、2?μL?dNTP?Mixture至20?μL，42℃水浴1～2?h，即得到cDNA溶液。

3、納米PCR反應(yīng)