[發(fā)明專利]微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶及其分離純化方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510096790.2
• 申請日: 2015-03-04
• 公開（公告）號: CN104651340A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設計）人: 冉艷紅;張亮;李弘劍;王偉;陳文燕
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12P19/00;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;陳燕嫻

技術領域

本發(fā)明屬于蛋白質分離純化與酶學特性研究及應用技術領域，特別涉及一種微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶及其分離純化方法與應用。

背景技術

桃膠系桃、李、杏、櫻桃等薔薇科植物樹干受機械傷(如蟲咬、切傷等)或致病后分泌出來的膠質半透明物質，為多糖類物質，由半乳糖和阿拉伯糖構成其多糖骨架的主要成分。桃膠已被用于食品、醫(yī)藥等領域。

近年來，低聚糖因具有抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生物學活性而備受關注，成為糖生物學新的研究熱點。利用酶解法加工原桃膠，不僅可以使原桃膠分解、生產具有廣泛工業(yè)用途的可溶性商品桃膠，更可以使桃膠多糖的骨架裂解，獲得功能性低聚糖。利用酶解法加工原桃膠，先決條件在于得到能裂解原桃膠的酶以及該酶在以桃膠為底物時的最佳酶解條件。

發(fā)明內容

本發(fā)明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶的分離純化方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述分離純化方法得到的微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：一種微桿菌來源的桃膠多糖裂解酶的分離純化方法，包括如下步驟：

(1)菌種的馴化：

①第一次馴化：將微桿菌A5種子液接種到含有質量百分比2％桃膠的LB培養(yǎng)基中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第一次馴化液；

②第二次馴化：將第一次馴化液接種到含有質量百分比4％桃膠的LB培養(yǎng)基中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第二次馴化液；

③第三次馴化：將第二次馴化液接種到含有質量百分比6％桃膠的LB培養(yǎng)基中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第三次馴化液；

④第四次馴化：將第三次馴化液接種到含有質量百分比8％桃膠的LB培養(yǎng)基中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到第四次馴化液；

⑤第五次馴化：將第四次馴化液接種到含有質量百分比10％桃膠的LB培養(yǎng)基中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠溶解，得到馴化好的種子液；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：將馴化好的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床中培養(yǎng)至桃膠完全溶解；發(fā)酵培養(yǎng)基為含有質量百分比6％桃膠的LB培養(yǎng)基，初始pH值為6；

(3)分離純化：

①將發(fā)酵液離心，去除菌體，取上清；

②在上清中加入硫酸銨至飽和，于4℃靜置過夜；離心收集沉淀，隨后用磷酸緩沖液將沉淀復溶；接著用磷酸緩沖液進行透析，期間更換磷酸緩沖液數次直至透析完全；透析結束后，透析液離心除去不溶雜蛋白，收集上清液待純化；

③將步驟②得到的上清液上樣到苯基瓊脂糖凝膠6FF(Phenyl?Sepharose?6Fast?Flow)柱中，收集第二個穿柱峰；

④對第二個穿柱峰上樣到Toyopearl?DEAE-650S柱中，接著用磷酸緩沖液進行平衡，而后再用0.6M?NaCl溶液進行洗脫，收集第一個洗脫峰；

⑤將第一個洗脫峰透析后凍干，得到桃膠多糖裂解酶。

步驟(1)①中所述的微桿菌A5已在專利號為“200910193340.X”、名稱為“桃膠分解酶生產菌株及其在制備桃膠多糖中的應用”中公開；

步驟(1)①中所述的微桿菌A5種子液優(yōu)選通過如下步驟得到：首先將微桿菌A5于LB平板上劃線；再挑菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖床中進行培養(yǎng)，得到微桿菌A5種子液；

本發(fā)明中所述的搖床的條件優(yōu)選設置為28～30℃、180～200rpm；更優(yōu)選為30℃、180rpm；

步驟(1)中所述的接種的量優(yōu)選為體積百分比7.5％；

步驟(2)中所述的接種的量優(yōu)選為體積百分比10％；

步驟(3)中所述的離心的條件優(yōu)選為4℃、10000rpm離心20min；

步驟(3)②中所述的磷酸緩沖液優(yōu)選為20mmol/L、pH6.0的磷酸緩沖液；

步驟(3)②中所述的透析完全為往磷酸緩沖液中滴入硝酸銀溶液時無沉淀；

步驟(3)③中所述的第二個穿柱峰的獲得條件優(yōu)選為：使用規(guī)格為的苯基瓊脂糖凝膠6FF層析柱，上樣流速為1.0ml/min，紫外檢測器的檢測條件為280nm；

步驟(3)④中所述的上樣的速度優(yōu)選為1.0ml/min；

步驟(3)④中所述的磷酸緩沖液的平衡的速度優(yōu)選為1.0ml/min；所述的磷酸緩沖液優(yōu)選為pH6、20mM的磷酸緩沖液；

步驟(3)④中所述的洗脫的速度優(yōu)選為1.0ml/min；