[發(fā)明專利]抗分化基因HA117在預(yù)判白血病預(yù)后的臨床應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510096382.7
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號: CN104726569A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金先慶;徐酉華;劉行;王寧;郭玉霞
• 申請（專利權(quán)）人: 金先慶
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/86;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種抗分化基因HA117的應(yīng)用。

背景技術(shù)

全身化療是治療腫瘤的主要手段，可以減少或者消除腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。然而，目前有兩大主要因素制約了化療的成功率：一是抗腫瘤藥物具有毒性，二是腫瘤細胞對抗癌藥物的抗藥性，尤其是“多藥抗藥性”，是癌癥死亡病人的最主要死因，約占死亡病人的九成。

“腫瘤細胞對一種抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性時，對結(jié)構(gòu)及作用機制不同的其他抗癌藥物也會產(chǎn)生交叉抗藥性。”符立梧介紹，這種“多藥抗藥性”是腫瘤化療失敗的最重要原因，目前臨床上仍無良策。

HA117是一種新的抗維生素A相關(guān)促分化作用的多藥耐藥基因。腫瘤耐藥的最重要原因，是腫瘤細胞膜上的‘ABC轉(zhuǎn)運泵’在腫瘤干細胞中的過度表達。”符立梧表示，“ABC轉(zhuǎn)運泵”的家族有49個成員，其中11個與多藥抗藥性有關(guān)。其中，最重要的當(dāng)屬ABCB1/P-gp、ABCC1/MRP1、ABCG2/BCRP這三種跨膜蛋白的過度表達。它們可將抗癌藥物泵出細胞外，使抗癌藥物在腫瘤細胞中的濃度降低，從而令腫瘤細胞產(chǎn)生抗藥性。因此，如果能夠及時的發(fā)現(xiàn)在化療過程中腫瘤細胞是否產(chǎn)生耐藥性或者是能夠構(gòu)建腫瘤耐藥細胞系以研究藥物的治療作用，對于提高腫瘤的治療效果是十分有益的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種抗分化基因HA117在判斷白血病危險度、療效及預(yù)判白血病預(yù)后的臨床應(yīng)用，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案。

本發(fā)明涉及一方面涉及抗分化基因HA117在預(yù)判白血病預(yù)后的臨床應(yīng)用，所述的抗分化基因HA117的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1，其特征在于包括如下步驟：取經(jīng)化療的白血病細胞，檢測其中是否含有及高表達抗分化基因HA117以判斷白血病細胞是否產(chǎn)生耐藥性，評估白血病預(yù)后。

在本發(fā)明的另一方面，還涉及抗分化基因HA117在制備耐藥性腫瘤細胞系中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的耐藥性腫瘤細胞系是指對氟尿嘧啶(5-FU)、長春新堿(VCR)、阿霉素(ADM)、柔紅霉素(DNR)和/或環(huán)磷酰胺(CTX)產(chǎn)生耐藥性的細胞系。

在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，所述的制備耐藥性腫瘤細胞系的步驟包括將含HA117基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞系中，篩選陽性腫瘤細胞系。

本發(fā)明的抗分化基因HA117是耐藥性腫瘤細胞系的標(biāo)志物，因此通過檢測抗分化基因HA117能夠?qū)Π籽☆A(yù)后進行預(yù)判，通過制備耐藥性腫瘤細胞系，用于腫瘤耐藥性研究，對于提高腫瘤的治療效果十分有益。

具體實施方式：

實施例1：

(1)用抗分化基因HA117的重組腺病毒轉(zhuǎn)染多種細胞后對多種抗癌藥物的耐藥性

抗分化基因HA117的DNA序列為SEQ?ID?NO.1

攜帶新基因HA117的重組腺病毒

采用改良的Adeasy-1腺病毒載體系統(tǒng)重組表達HA117基因的重組腺病毒Ad5-HA117

一、HA117基因構(gòu)建質(zhì)粒pAdTrack-HA117

1.已克隆的HA117目的基因片段的收獲

PCR擴增目的片段

PCR產(chǎn)物的純化及鑒定

2.含HA117目的基因的質(zhì)粒pAdTraek-HA117的克隆合成

1)酶切載體pAdTrack-CMV和目的基因HA117

2)用去磷酸化酶將酶切后的載體去磷酸化，收獲載體DNA

3)目的基因HA117的DNA的純化

4)T4DNA連接酶連接載體和目的基因

5)轉(zhuǎn)導(dǎo)重組質(zhì)粒入感受態(tài)細胞

6)PCR法篩選克隆

7)酶切鑒定重組質(zhì)粒

8)目的基因HA117的基因測序鑒定

二、腺病毒BJ-Adeasy細胞的制備

三、重組腺病毒Adeasy-HA117構(gòu)建

1.限制性內(nèi)切酶Pine?1酶切pAdTrack-HA117的質(zhì)粒DNA

2.CaCl2法轉(zhuǎn)導(dǎo)酶切后的質(zhì)粒pAdTrack-HA117入腺病毒同源穿梭質(zhì)粒BJ-Adeasy

3.篩選出已導(dǎo)入HA117的質(zhì)粒BJ-Adeasy-HA117

4.轉(zhuǎn)導(dǎo)BJ-Adeasy-HA117入感受態(tài)細胞

5.進一步酶切鑒定Adeasy-HA117