[發明專利]一種Arm-PCR擴增子長度可調的引物設計方法

有效

• 申請號: 201510095687.6
• 申請日: 2015-03-04
• 公開（公告）號: CN104611458B
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 方雪恩;王麗娟;陳旭;徐凌佳;孔繼烈
• 申請（專利權）人: 上海速芯生物科技有限公司;復旦大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種Arm-PCR擴增子長度可調的引物設計方法，其特征在于：所述Arm-PCR擴增子長度可調的引物設計方法通過以下步驟實現：

a、通過icubate 2.0在線軟件設計Arm-PCR引物；

b、在Arm-PCR內向上下游引物的接頭序列后加T連接子；

c、Arm-PCR反應體系的配制；

d、Arm-PCR反應條件的設定與運行；

e、以轉基因大豆GTS40-3-2NOS終止子的質粒為模板進行Arm-PCR產物的毛細管電泳檢測；

步驟b中在Arm-PCR第一步擴增反應所需要的內向上下游引物的接頭序列后各加1個T、2個T、3個T、4個T或5個T連接子，從而使PCR擴增子的長度改變2bp、4bp、6bp、8bp或10bp；

引物組包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向內引物Fi、反向內引物Ri，用于Arm-PCR的第一步擴增；5’端ROX標記的超級上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步擴增，以下6組引物都是在第一組內向上下游引物Fi和Ri的接頭序列后加T連接子，用于第一步擴增的引物組的核苷酸序列分別如下所示：

1)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC；

Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；

2)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTAGATTGAATCCTGTTGCC；

Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；

3)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTAGATTGAATCCTGTTGCC；

Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；

4)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTAGATTGAATCCTGTTGCC；

Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；

5)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTTAGATTGAATCCTGTTGCC；

Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；或

6)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；

Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTTTAGATTGAATCCTGTTGCC；

Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；

Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；

用于第二步擴增的超級上、下游引物的核苷酸序列為：

超級上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；

超級下游引物Fs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。

2.根據權利要求1所述的一種Arm-PCR擴增子長度可調的引物設計方法，其特征在于：利用Arm-PCR檢測引物組進行Arm-PCR反應，以轉基因大豆GTS40-3-2NOS終止子的質粒為模板；PCR擴增反應：在PCR管中配制第一步反應體系：引物液2.5μl，反應液Mix 12.5μl，GTS40-3-2NOS終止子質粒2～5μl，用滅菌去離子水補齊到25μl；設置空白對照反應時，用雙蒸水代替模板；將配制好的PCR管混勻后離心，并于95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，15個循環；94℃15s，70℃90s，6個循環；60℃延伸30min，最后4℃保存；第二步PCR反應體系為：超級引物液1μl，反應液Mix 12.5μl，第一步PCR反應產物1～2μl，用滅菌去離子水補齊到25μl；將配制好的PCR管混勻后離心，并于95℃15min；94℃30s，60℃90s，72℃60s，30個循環；60℃延伸30min，最后4℃保存；結果判斷：通過毛細管電泳檢測Arm-PCR擴增結果。