[發明專利]一種豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201510095320.4
• 申請日: 2015-03-04
• 公開（公告）號: CN104651534A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 彭昊;李軍;馮世文;潘艷;陳澤祥;胡帥;楊威;鐘舒紅;謝宇舟;禤雄標
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李珊

1.一種豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括LAMP引物、2×反應緩沖液、Bst?DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和豬圓環病毒DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3（SEQ?ID?NO：1）與B3（SEQ?ID?NO：2）、內引物FIP（SEQ?ID?NO：3）與BIP（SEQ?ID?NO：4）和環引物LF（SEQ?ID?NO：5）與LB（SEQ?ID?NO：6）；

其中：

F3??GGGAGTCTGGTGACCGTT

B3??CCATCCCACCACTTGTTTCT

FIP??ACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG

BIP?CACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG

LF?TTCAAAAGTTCAGCCAGCCC

LB?TGTGGTAAAAGCAAATGGGCT；

所述的2×反應緩沖液是Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

2.根據權利要求1所述的豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，所述的豬圓環病毒DNA模板提取自豬圓環病毒培養物，是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取。

3.根據權利要求1所述的豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。

4.根據權利要求1所述的豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于，所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL?35-55mM、KCL?10-30mM、MgSO₄?15-28mM、(NH₄)₂SO_4?18-28mM、Tween20?0.5-1.5℅、Betaine?1.3-3.5M?和dNTPs?2.4-4.8mM。

5.一種豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，于獸醫臨床上檢測疑似豬圓環病變組織是否含有豬圓環病毒，具體檢測步驟包括：

（1）LAMP引物的設計與合成

（2）檢測豬圓環病毒DNA模板的提取

（3）LAMP反應體系建立

（4）LAMP檢測方法。

6.根據權利要求5所述的豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，所述的LAMP反應體系建立以25μl計，

2×反應緩沖液???????????????????????12.5?μL

Bst?DNA聚合酶??????????????????????1?μL

FIP?????????????????????????????????40?pmol

BIP?????????????????????????????????40?pmol

F3??????????????????????????????????5?pmol

B3??????????????????????????????????5?pmol

豬圓環病毒DNA?????????????????????2?μL

超純水??????????????????????????????補足25?μL。

7.根據權利要求5所述的豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。

8.根據權利要求5所述的豬圓環病毒環介導等溫擴增試劑盒的應用，其特征在于，所述的LAMP檢測方法采用實時濁度儀進行密閉全程監控。