[發明專利]煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-細胞色素P450還原酶及其應用

有效

• 申請號: 201510095010.2
• 申請日: 2015-03-03
• 公開（公告）號: CN104894077B
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 周志華;王平平;嚴興;范云
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;C12P33/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

本發明涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)?細胞色素P450還原酶及其應用。本發明首次揭示了人參來源的NADPH?細胞色素P450還原酶，其具有良好的輔酶特性，可協助細胞色素P450發揮催化活性，促進底物達瑪烯二醇生成原人參二醇。本發明還揭示了編碼所述NADPH?細胞色素P450還原酶的多核苷酸，表達所述NADPH細胞色素P450還原酶的表達載體及宿主細胞，以及生產原人參二醇的方法。應用人參來源的NADPH?細胞色素P450還原酶，可顯著提高原人參二醇的生產效率，進而提高人參皂苷生物合成產量。

技術領域

本發明涉及生物技術和植物生物學領域；更具體地，本發明涉及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-細胞色素P450還原酶及其應用。

背景技術

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-細胞色素P450還原酶(EC1.6.2.4CytochromeP450 Reductase，CPR)是細胞色素P450(CYP)催化體系中重要的組成部分。細胞色素P450催化的氧化還原反應中需要電子(還原力)的供應，NADPH-細胞色素P450還原酶可以通過從電子供體獲得電子后傳遞給CYP，為CYP所催化的反應提供還原力。如果沒有CPR的存在時，CYP對底物就沒有催化活性。NADPH-細胞色素P450還原酶屬于核黃素蛋白家族，是一種膜蛋白并具有與輔酶FMN，FAD和NADPH結合的保守結構域。

由于CPR的結構域進化上非常穩定，因此在研究細胞色素P450的催化活性時，如果沒有對應物種的CPR，通常會使用來源于其他物種的CPR代替。但是，兩個酶來源的物種親緣關系較遠，則催化效率會明顯降低。例如在丹參酮合成的例子中，使用來源于擬南芥的CPR(ATR1)促進丹參合成中的P450酶CYP76AH1作用，丹參酮的前體鐵銹醇(ferruginol)的產量為2.1mg/L，而使用丹參自身來源的CPR(smCPR1)與丹參合成中的P450酶CYP76AH1協同作用能顯著提高鐵銹醇的產量至10.5mg/L。相比于已經報道的數量龐大的CYP(1萬多個)而言，目前僅有不到100個CPR被鑒定，多數CYP并未有與其相對應的CPR協同作用。因此從同一物種或者親緣關系較近的物種中克隆CPR會給CYP提供更合適的CPR，使這些CYP能更有效的發揮作用。

人參(Panax ginseng C.A.Mey.)中的主要活性物質人參皂苷的合成途徑中需要兩個CYP(CYP716A47和CYP716A53v2)的作用，CYP716A47可對達瑪烯二醇(dammarenediol-II Dm)進行羥基化修飾合成原人參二醇(protopanaxadiol PPD)，而CYP716A53v2可對PPD進行羥基化修飾合成原人參三醇(protopanaxatriol PPT)，原人參二醇和原人參三醇是各種人參皂苷合成的前體，通過多種糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferase)進行糖基化修飾后合成多種具有不同生物活性的人參皂苷。雖然目前這個兩個CYP基因已經被克隆和鑒定，但是尚無人參中的NADPH-細胞色素P450還原酶被克隆。以往的研究中這兩個CYP所需的CPR都是用來源于擬南芥的CPR(ATR1、ATR2-1)等來代替。雖然與擬南芥來源的CPR配合，這些人參來源的CYP也具有催化活性，但由于擬南芥與人參的親緣關系較遠，其催化活性還有待提高。因此，本領域有必要開發更為適用的NADPH-細胞色素P450還原酶。

發明內容

本發明的目的在于提供煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-細胞色素P450還原酶及其應用。

在本發明的第一方面，提供分離的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-細胞色素P450還原酶，所述的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-細胞色素P450還原酶選自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24任一所示的多肽；或