[發明專利]利用人工合成MV3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法

有效

• 申請號: 201510093048.6
• 申請日: 2015-03-02
• 公開（公告）號: CN104846005B
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 郭晉隆;高世武;許莉萍;闕友雄;蘇亞春;吳期濱;林慶良
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 福州市眾韜專利代理事務所(普通合伙)35220
• 代理人: 陳智雄,黃秀婷

1.一種利用人工合成MV3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV3序列的人工合成、RNAi干擾載體構建、抗花葉病轉基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在于：

（1）MV3序列的人工合成：

從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯在一起，獲得MV3序列，同時在正義鏈5′端加入Xba I和 Xho I酶切位點，反義鏈5′端加入Cla I和Kpn I酶切位點，采用人工合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下：

GATCTAGACT CGAGATGGAA AAAAGTTACG TCGATCTCTT AAACCAAGCA TGGGCAGATT

TGCCATTACA TTCAAAATTA TATTCAATTT GGCGTGTGTA CGAAGTCAAG AAATATTACA

AGCCGTGCTT AGTCCTGAAA AGAGGCGTAG ATTTAGGCGC AATGTACAAT ATCTCAGCTA

CGCATCAAAT ATCAAGTTTA GTGCAGAAAA GTCGAGATCA AGTCAGCTCT ATTTCAACCA

AACTCCACCA CAGTTTATGT AATAATGGAA AAAAATTATG TAGATCAATT AAACCAGTCA

TGGGCAGAAT TATCATACTG TGGAAAATTT TCAGCAATAT GGCGTGTGTT CAGAGTCAAG

AAATACTACA AGCCATCTTT AACCGTGAGA AAAAGCGTAG ATTTAGGCGC TGTTTACAAT

ATATCAGCTA CGCATCTAAT ATCAGATTTA GTGCAGAGAA GTCGAGATCG AGTCAGCTCT

ACTTTAACCA AACTCCGCAA CGGTTTCTAG GTACCATCGA TAG；

（2）RNAi載體構建：

（a）目的片段Ⅰ的獲得：利用限制性內切酶Xho I 和Kpn I將目的片段A進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段Ⅰ；目的片段Ⅰ的序列為序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

（b）目的片段Ⅱ的獲得：將pHANNIBAL載體質粒DNA用限制性內切酶Xho I和Kpn I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段Ⅱ，目的片段Ⅱ的序列為序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

（c）中間載體B的獲得：將回收的目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體B；所述中間載體B是指將目的片段Ⅰ插入到pHANNIBAL載體后獲得的載體；

（d）目的片段Ⅲ的獲得：提取中間載體B的質粒DNA，并用限制性內切酶Cla I 和Xba I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段Ⅲ；目的片段Ⅲ的序列為序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

（e）目的片段Ⅳ的獲得：將目的片段A用限制性內切酶Cla I 和Xba I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段Ⅳ；目的片段Ⅳ的序列為序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

（f） 中間載體C的獲得：將回收的目的片段Ⅲ和目的片段Ⅳ用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆驗證，獲得中間載體C；所述中間載體C是指將目的片段Ⅳ插入到中間載體B后獲得的載體；

（g）目的片段Ⅴ的獲得：提取中間載體C的質粒DNA，并用限制性內切酶Not I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段Ⅴ；目的片段Ⅴ的序列為序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

（h）目的片段Ⅵ的獲得：將植物表達載體pGreenII0229質粒DNA用限制性內切酶Not I進行酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收目的片段Ⅵ；目的片段Ⅵ的序列為序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

（i）抗甘蔗花葉RNAi載體pG0229i-MV3的獲得：將回收的目的片段Ⅴ和目的片段Ⅵ用T4-DNA連接酶進行連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆驗證，獲得可用于遺傳轉化甘蔗受體材料的RNAi載體pG0229i-MV3；

（3）抗花葉病轉基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定：提取構建完成的RNAi載體pG0229i-MV3質粒DNA，用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，并將其定量至1 μg/μL，基因槍轟擊法遺傳轉化甘蔗，分子檢測獲得再生陽性轉基因植株，并進行抗病轉基因甘蔗的抗病性鑒定。

2.根據權利要求1所述的一種利用人工合成MV3序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，其特征在于所述從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯在一起，即將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進行多序列比對，從中各選取1條100%同源的序列區段串聯在一起，共495bp。