[發(fā)明專利]利用人工合成MV4序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510092981.1
• 申請日: 2015-03-02
• 公開（公告）號: CN104846004B
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設計）人: 郭晉隆;高世武;許莉萍;闕友雄;蘇亞春;吳期濱;林慶良
• 申請（專利權）人: 福建農(nóng)林大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 福州市眾韜專利代理事務所(普通合伙)35220
• 代理人: 陳智雄,黃秀婷

技術領域

本發(fā)明涉及一種培育甘蔗抗病品種的方法，具體涉及一種利用人工合成MV4序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

甘蔗花葉病又名甘蔗嵌紋病，是世界上各產(chǎn)蔗國普遍發(fā)生的一類病毒病，此病在許多國家被列為重要病害，甘蔗感病后一般減產(chǎn)10％～40％，同時如出汁率、還原糖、蔗糖分等一些工藝性狀也受到不同程度的影響。目前，已明確引起甘蔗花葉病的病原至少有3種：甘蔗花葉病毒(Sugarcane Mosaic Virus,ScMV)、高粱花葉病毒(Sorghum Mosaic Virus,SrMV)和甘蔗線條花葉病毒。其中甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒在我國蔗區(qū)普遍分布，這兩種病毒屬馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員，為單鏈正義RNA病毒，基因組結(jié)構簡單，編碼10個成熟蛋白，分別為P1、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。目前，世界蔗區(qū)至少存在有7個ScMV和SrMV病毒株系，包括屬于ScMV的株系ScMV-A,B,D,E和屬于SrMV的株系SrMV-H,I,M。研究者先后將單一的CP及HC全序列基因?qū)氲礁收嶂校@得了對甘蔗花葉病的抗性明顯提高的轉(zhuǎn)基因甘蔗。但研究表明，蔗區(qū)中花葉病毒的優(yōu)勢株系在自然條件下也會發(fā)生變化，并產(chǎn)生新的株系。因此，僅以單一株系的花葉病毒的單一基因為靶標的轉(zhuǎn)基因改良顯然無法應對蔗區(qū)病原株系多樣化、復雜化以及優(yōu)勢株系的變化。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后基因表達沉默機制，構建可轉(zhuǎn)錄為雙鏈RNA(dsRNA)的植物表達載體并轉(zhuǎn)化植物，可實現(xiàn)植物目標基因的可遺傳的基因沉默，而且，引發(fā)RNAi的片段并不需要完整的基因序列，還可以是多個病毒的不同基因片段的嵌合體，為此，我們將收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分別進行多序列比對，從中各選取1條100％同源的序列區(qū)段，采用人工合成的方式串聯(lián)在一起，作為RNAi(RNA interference)片段，構建反向重復序列，得到一個RNAi載體。通過基因槍轟擊法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，獲得具有沉默病毒基因表達效果的轉(zhuǎn)基因甘蔗。

專利號為ZL20071009226.8的發(fā)明專利“利用SrMV-P1基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法”，介紹了一種利用SrMV-P₁基因培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括SrMV-P₁基因的克隆、抗花葉病甘蔗轉(zhuǎn)P₁基因植物表達載體的構建、抗甘蔗花葉病轉(zhuǎn)P₁基因材料的培育以及抗病高產(chǎn)高糖轉(zhuǎn)基因甘蔗新材料的篩選鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用人工合成序列MV4培育抗花葉病甘蔗品種的方法。針對現(xiàn)有蔗區(qū)甘蔗花葉病嚴重的問題，人工合成可同時沉默甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒的新型核酸序列，構建RNAi載體，通過基因槍轟擊法進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得對花葉病高抗的轉(zhuǎn)基因甘蔗。

本發(fā)明的目的是通過以下方法實現(xiàn)的。

本發(fā)明的利用人工合成MV4序列培育抗花葉病甘蔗品種的方法，包括MV4序列的人工合成、RNAi載體構建、抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗材料的培育及抗病性鑒定；其特征在于：

(1)MV4序列的人工合成：

從ScMV和SrMV核酸序列中各選取一段串聯(lián)在一起，獲得MV4序列，同時在正義鏈5′端加入Xba I和Xho I酶切位點，反義鏈5′端加入Cla I和Kpn I酶切位點，采用人工合成的方式，獲得目的片段A，其序列如下：

GATCTAGACT CGAGATGAGC GGACTAATGG TATGGTGCAT AGAAAATGGT TGCTCACCGA

ACATCAATGG TGTTTGGACC ATGATGGATG GAGAAGAACA AAGAACATTT CCTTTAAAGC

CAATAATTGA AAATGCTTCT CCAACATTTA GGCAGATTAT GCATCACTTT AGTGATGCAG

CTGAAGCGTA TATAGAATAC CGTAACTCAA CGGAACGCTA CATGCCAAGA TACGGACTTC