[發明專利]一種特異識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體

有效

• 申請號: 201510092444.7
• 申請日: 2015-03-02
• 公開（公告）號: CN104593374B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發明（設計）人: 王周平;張維瀟;段諾;吳世嘉;夏雨
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/53;G01N1/40
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及到利用一種SELEX技術(指數富集的配體系統進化技術)制備一種與棒曲霉素高特異性和高親和力的核酸適配體，為該核酸適配體在快速檢測棒曲霉素提供基礎。

背景技術

棒曲霉素(Patulin)是由青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬產生的真菌代謝產物，主要在蘋果及其制品中常見。棒曲霉素對熱穩定，100℃加熱15分鐘仍然不能破壞其結構，且在酸性溶液及有機溶劑中能長期保存。棒曲霉素曾因為其抑制多種菌生長而被用作抗生素，它具有引起抽搐、腸道出血、肺部出血、腎臟損害等急性毒性，同時具有神經毒性、免疫毒性、基因毒性、致畸、致癌等慢性毒性。目前檢測棒曲霉素的方法有：薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜法(LC)、反相高效液相色譜(reveresed-phase HPLC)、色譜聯用技術(GC/MS,LC/MS)、酶聯免疫法(ELISA)等。這些方法檢出限低、精密度高，但操作復雜、檢測成本高。構建一種快速、簡單、低成本的棒曲霉素檢測方法有重要意義。

適配體是一種能以高親和力與各靶分子特異結合的單鏈寡核苷酸，一般通過指數富集配體的系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)篩選得到。適配體以其從體外制備、高親和性、高特異性、獲得方便、易修飾等的優勢引起了國內外科研人員的廣泛研究。目前對于小分子物質的適配體篩選方法主要有親和層析法、磁珠法、毛細管電泳法等，主要通過將靶分子活化后固定在固載物質上，從而將與靶分子結合的適配體分離出來。這種方法對靶分子結構有較高的要求，即其結構中含有易活化基團，并且活化之后對原結構產生較小的變化和影響。氧化石墨烯可以通過π-π堆疊作用吸附ssDNA，但不易吸附與靶分子結合而產生構象折疊后的ssDNA，可以用來分離與靶分子結合的適配體。

在發明中，將氧化石墨烯作為SELEX篩選的分離方法，避免改變小分子棒曲霉素的結構，避免活化將其固定于載體上，只需直接利用氧化石墨烯對ssDNA的強吸附作用，將未與靶標結合的ssDNA去除，實現對直接對天然的棒曲霉素的適配體的篩選。獲得高親和性高特異性與棒曲霉素結合的寡核苷酸適配體后，可將其化學修飾，用于發展簡單便捷的檢測棒曲霉素的方法。

發明內容

本發明目的在于提供一種對完整靶分子檢測方法，特別涉及一種能特異結合棒曲霉素的適配體，為發展快速、便捷檢測棒曲霉素的方法奠定基礎。

本發明方法利用指數級富集配體的系統進化技術(SELEX技術)，以氧化石墨烯為分離方法，無需將靶分子固定在載體上，以棒曲霉素完整的結構為靶標，篩選獲得與靶分子高親和性特異結合的適配體。最終通過12輪的篩選，獲得與棒曲霉素高親和性高特異性結合的最佳寡核苷酸適配體。

本發明的優點：

與抗體和酶相比，避免了傳統抗體制備中動物實驗過程，而直接從體外文庫中選擇；適配體對體外篩選靶分子顯示出高特異性和親和力，目標范圍廣；獲得方便，合成的重現性好，通過化學合成和修飾可以增強其穩定性；化學性質更穩定，保存時間長；避免將小分子靶標固定在載體上；避免小分子靶標的結構變化。

附圖說明

圖1是PAT-11寡核苷酸適配體的模擬二級結構圖。

圖2是PAT-11寡核苷酸適配體的飽和結合曲線圖。

圖3是PAT-11寡核苷酸適配體的特異性試驗結果。

具體實施方式：

以下是通過SELEX技術篩選特異結合棒曲霉素的核酸適配體的進一步說明。

1、合成隨機單鏈DNA文庫和引物(IDT公司合成)

隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫：5′-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT(N40)GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3′，構建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40個堿基的隨機序列，庫容量為10¹⁴以上；上游引物Ⅰ：5′-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3′；下游引物Ⅱ：5′-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3′，將隨機ssDNA文庫和兩種引物均用TE緩沖液配制成100μmol/L貯存液-20℃貯存備用。

2、ssDNA的制備及純化