[發明專利]一種抑制膠質瘤生長的過表達BDNF的間充質干細胞的制備方法及其臨床應用

在審

• 申請號: 201510092005.6
• 申請日: 2015-03-02
• 公開（公告）號: CN104593421A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發明（設計）人: 劉爽
• 申請（專利權）人: 劉爽
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/12;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種抑制膠質瘤生長的過表達BDNF的間充質干細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括通過獲取BDNF基因片段，構建到病毒載體上，轉染人間充質干細胞制備成過表達BDNF的間充質干細胞；體外實驗中與膠質瘤干細胞共培養，啟動了膠質瘤干細胞中microRNA-124表達，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表達，從而抑制了膠質瘤干細胞增殖和成球生長能力；體內實驗中抑制膠質瘤的生長和轉移復發。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，通過正常組織中PCR擴增或者化學合成BDNF基因片段，經酶切位點連接到病毒載體上，包裝到病毒表達系統上后轉染人間充質干細胞，獲得過表達BDNF的間充質干細胞。

3.根據權利要求1-2任一項所述的制備方法，其特征在于，所述間充質干細胞來源人廢棄臍帶、胎盤、自體骨髓或自體脂肪組織；優選地，來源于人自體骨髓。

4.根據權利要求1-3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述病毒表達系統為慢病毒系統、腺病毒系統、逆轉錄病毒系統；優選地，選擇慢病毒表達系統。

5.根據權利要求1-4任一項所述的制備方法，其特征在于，所述過表達BDNF的間充質干細胞，體外與膠質瘤干細胞共培養，啟動了膠質瘤干細胞中microRNA-124的表達，其靶基因STAT3、Akt和RelA表達顯著下降，使得膠質瘤干細胞增殖能力和成球生長能力明顯地降低。

6.根據權利要求1-5任一項所述的制備方法，其特征在于，所述過表達BDNF的間充質干細胞，在動物體內殺瘤試驗中促使了膠質瘤中microRNA-124的表達，使得其靶基因STAT3、Akt和RelA表達顯著下降，炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌也明顯降低，使得膠質瘤大小顯著縮小并且轉移明顯得到抑制。

7.根據權利要求1-6任一項所述的制備方法，其特征在于，BDNF基因片段通過正常組織中PCR擴增或者化學合成法獲得，引入雙酶切位點連接到病毒載體上，取對數生長期的293T細胞，以(2～2.5)×10⁶細胞數接種于10cm的細胞培養皿中，于37℃、5％CO₂培養箱中培養24小時，細胞融合度為60％～80％時利用Lipofectamine^TM2000轉染進行病毒包裝；轉染分為2組：陽性組和對照組；48～72小時后收集病毒上清液，4℃、3000r/min離心5分鐘后，用直徑為0.45μm的濾膜過濾分裝，用于細胞感染；將兩組病毒上清分別感染人間充質干細胞，同時加入工作液濃度為5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培養基，更換為DMEM/F12完全培養基，感染后72小時熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(Green?fluorescent?protein，GFP)的發光情況，GFP顯色超過90％以上，表明攜帶BDNF目的基因病毒轉染人間充質干細胞成功，獲得過表達BDNF的間充質干細胞。