[發(fā)明專利]一種促膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法及其臨床應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510092004.1
• 申請(qǐng)日: 2015-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN104593420A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉爽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉爽
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86;C12N15/12;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種促腫瘤干細(xì)胞分化的過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括通過獲取BMP4基因片段，構(gòu)建到病毒載體上，轉(zhuǎn)染人神經(jīng)干細(xì)胞制備成過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞；在體外實(shí)驗(yàn)中與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)，BMP-4與BMP受體結(jié)合活化，可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能轉(zhuǎn)移到腫瘤病灶位，抑制膠質(zhì)瘤的生長和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，通過正常組織中PCR擴(kuò)增或者化學(xué)合成前體BMP4基因片段，經(jīng)酶切位點(diǎn)連接到病毒載體上，包裝到病毒表達(dá)系統(tǒng)上后轉(zhuǎn)染人神經(jīng)干細(xì)胞，獲得過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，人廢棄臍血、胎盤血或自體骨髓經(jīng)體外培養(yǎng)獲得所述人神經(jīng)干細(xì)胞；其具有表達(dá)巢蛋白的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物特征；優(yōu)選地，所述人神經(jīng)干細(xì)胞來源于人自體骨髓。

4.根據(jù)權(quán)利要求2-3任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述的病毒表達(dá)系統(tǒng)為慢病毒表達(dá)系統(tǒng)、腺病毒表達(dá)系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)；優(yōu)選地，選擇慢病毒表達(dá)系統(tǒng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞，在體外與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)，CD133表達(dá)下降，使得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖能力和成球生長能力明顯地降低。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞，在動(dòng)物體內(nèi)殺瘤試驗(yàn)中CD133表達(dá)顯著下降，使得膠質(zhì)瘤大小顯著縮小并且轉(zhuǎn)移明顯得到抑制。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，BMP4基因片段通過正常組織中PCR擴(kuò)增或者化學(xué)合成法獲得，引入雙酶切位點(diǎn)連接到病毒載體上，取對(duì)數(shù)生長期的293FT細(xì)胞，以(2～2.5)×10⁶細(xì)胞數(shù)接種于10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞融合度為60％～80％時(shí)利用Lipofectamine^TM2000轉(zhuǎn)染進(jìn)行病毒包裝；轉(zhuǎn)染分為2組：陽性組和對(duì)照組；48～72小時(shí)后收集病毒上清液，4℃、3000r/min離心5min后，用直徑為0.45μm的濾膜過濾分裝，用于細(xì)胞感染；將兩組病毒上清分別感染人神經(jīng)干細(xì)胞，同時(shí)加入工作液濃度為5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培養(yǎng)基，更換為DMEM/F12完全培養(yǎng)基，感染后72小時(shí)熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(Green?fluorescent?protein，GFP)的發(fā)光情況；GFP顯色超過90％以上，表明攜帶BMP4目的基因病毒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)干細(xì)胞成功，獲得過表達(dá)BMP4的神經(jīng)干細(xì)胞；所述DMEM/F12完全培養(yǎng)基含1×B27、20ng/mL表皮生長因子和20ng/mL堿性成纖維生長因子。