[發明專利]一種提高團花遺傳轉化瞬時表達效率的方法

有效

• 申請號: 201510089674.8
• 申請日: 2015-02-27
• 公開（公告）號: CN104630261A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 黃浩;白隆華;翟勇進
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區藥用植物園
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/56
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

技術領域

本發明屬于植物轉基因技術領域。具體涉及一種提高團花遺傳轉化瞬時表達效率的方法。

背景技術

團花(Neolamarckia?cadamba)，又稱黃梁木，為我國南方鄉土闊葉樹種，由于生長迅速，樹干通直，因而被譽為“奇跡樹”，早在20世紀70年代就受國內外普遍關注。其材性與杉木相當，速生性與桉樹、楊樹相近，是較好的用材和紙漿原料樹種；樹皮含有豐富的生物堿類，其中3α-二氫卡丹賓和3β-二氫卡丹賓為治療高血壓藥物“鉤藤總堿”的有效成分，具有強而持久的降壓作用，其效價已經接近利血平(Endo?K,Oshima?Y,Kikuchi?H,et?al.Hypotensive?principles?of?Uncaria?hooks.Planta?medica.1983,49(3):188-190)，這2個生物堿類在鉤藤中僅為微量成分存在，而在團花樹皮中作為僅次于卡丹賓含量的主要成分存在，是較好藥源樹種；此外，團花也是優良的園林綠化樹種、蜜源樹種、飼料樹種。由于團花用途廣、潛在經濟價值大，有著廣闊的開發前景。雖然團花有較好的速生、豐產特性，但抗寒性弱，在我國可進行人工栽培的區域受到制約；利用傳統的常規育種進行抗性選育，存在周期長、變異不確定等問題；而利用植物基因工程方法對團花進行遺傳改良，具有育種目標明確、費用低、操作簡單、重復性好、育種周期較常規育種短的優點。

農桿菌介導的遺傳轉化技術已廣泛用于獲取新品種或進行種質改良的研究，但獲得轉基團植株與再生體系、農桿菌株類型和浸染濃度、共培養方法和時間等諸多因素有關，這些因素組成一個完整的遺傳轉化系統，任何一個因素的效率偏低，均會導致遺傳轉化效率的下降甚至無法獲得轉基因植株。

目前，采用團花大田枝芽(鄧小梅，詹艷玲，張倩，等.黃梁木組培快繁技術研究.華南農業大學學報.2012,33(2):216-219；林碧珍，張樹河，林加耕.團花樹組培快繁技術研究.中國熱帶農業.2009(3):46-47.)、種子無菌苗子葉或下胚軸(黃浩.黃梁木地理變異和再生系統的建立.華南農業大學學位論文,2014.)作為外植體，通過組織培養獲得再生植株已獲成功，由于鄧小梅等、林碧珍等人采用大田枝芽作為外植體的方法，是通過直接器官再生方式獲再生植株，該方法并不適合團花進行遺傳轉化；而黃浩采用種子無菌苗子葉或下胚軸為外植體，是經過愈傷組織的間接器官再生方式獲得再生植株的方法，正是普遍用于植物遺傳轉化的再生方法。在前期，我們已利用常規的農桿菌介導遺傳轉化方法對團花進行了試驗，但瞬時表達效率較低，轉化效率很極低。因此，需進一步對團花遺傳轉化方法進行了優化，目的是建立一種團花高效遺傳轉化的技術，為團花遺傳改良特別是抗寒、抗蟲的改良提供技術基礎。

經文獻檢索，尚無團花遺傳轉化的相關報道。

發明內容

本發明針對團花在農桿菌介導的遺傳轉化中瞬時表達率低，轉化效率低的問題，提供一種提高遺傳轉化瞬時表達率的方法。通過農桿菌介導法將外源基因導入團花受體細胞，提高外源基因的轉化效率，建立由農桿菌介導的團花遺傳轉化體系。

本發明所述的提高團花遺傳轉化瞬時表達效率的方法，包括如下步驟：

1.材料選擇

選擇20～25d的無菌團花幼苗,切取胚軸和帶柄子葉為外植體；

選擇帶GUS基因的植物表達載體pBI?121，通過CaCl₂法導入農桿菌C58或LBA4404，獲得菌液C或菌液L，菌液C為帶植物表達載體pBI?121的農桿菌C58菌液，菌液L為帶植物表達載體pBI?121的農桿菌LBA4404菌液；

植物表達載體pBI?121、農桿菌C58和LBA4404均由生物公司購買獲得。

2.菌液制備

吸取50μL的菌液C或菌液L，轉移到質量體積濃度比為50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和25mg/L鏈霉素的100mL?YEB液體培養基中，于22℃、130r/min振蕩培養至菌液OD₆₀₀值為0.8，然后于5000r/min離心10min收集菌體，再用200mL?DCR液體培養基重懸，于28℃、130r/min振蕩培養，至菌液OD₆₀₀值為0.8～1.0，此時帶菌液C或菌液L的DCR液體即為遺傳轉化浸染液。

所述YEB培養基成分為：5.0g/L牛肉浸膏，1.0g/L酵母粉，5.0g/L蛋白胨，5.0g/L蔗糖，0.04g/L?MgSO₄·7H₂O，pH值為7.0；