[發明專利]一種白背三七細胞懸浮培養體系的構建方法

無效

• 申請號: 201510085930.6
• 申請日: 2015-02-22
• 公開（公告）號: CN104686340A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 楊業容
• 申請（專利權）人: 楊業容
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 玉林市振盛專利商標代理事務所 45109
• 代理人: 吳安儀

1.一種白背三七細胞懸浮培養體系的構建方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

（1）外植體消毒：選取白背三七嫩葉用清水洗凈，在工作臺中用2%～5%的洗潔精溶液漂洗1～5min，無菌水沖洗3～5次后用75%～80%乙醇溶液浸泡10～30s，0.1%～0.2%升汞溶液消毒5～10min，2%～4%次氯酸鈉溶液消毒10～20min，無菌水沖洗4～6次，然后接種到誘導培養基上進行誘導培養,接種后先在25～28℃條件下全暗培養20～30天，然后置于每天光照12～15小時，光照強度為1500～2500lx，培養溫度為25～28℃的條件下培養起直至形成愈傷組織；

（2）增殖培養：挑選狀態較為一致的愈傷組織接種到增殖培養基上進行增殖培養，接種后先在25～28℃條件下全暗培養7～14天，然后置于每天光照12～15小時，光照強度為1500～2500lx，培養溫度為25～28℃的條件下培養，15～20天轉接一次；

（3）液體培養：選取疏松易碎、有金屬光澤、生長旺盛的胚性愈傷組織用鑷子夾碎后接種于液體培養基中在轉速為100～150r/min，光照強度為800～1200lx，培養溫度為25～28℃的條件下進行振蕩培養；

（4）懸浮細胞系建立：用40～50目的過濾篩對懸浮初期培養物進行過濾，以除去大細胞團，保留分散程度好的小細胞及單細胞，按1:3～1:2的體積轉入新鮮培養液，懸浮培養周期為6～9天，多次繼代建立懸浮細胞系。

2.根據權利要求1所述的一種白背三七細胞懸浮培養體系的構建方法，其特征在于步驟（1）所述的誘導培養基為MS+1～4mg/L?KT+0.2～0.8mg/L?NAA+0.5～2.0mg/L?6-BA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。

3.根據權利要求1所述的一種白背三七細胞懸浮培養體系的構建方法，其特征在于步驟（2）所述的增殖培養基為：B₅+0.1～0.5mg/L?NAA+1～3.0mg/L?6-BA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%瓊脂，pH值為5.4～5.8。

4.根據權利要求1所述的一種白背三七細胞懸浮培養體系的構建方法，其特征在于步驟（3）所述的液體培養基為：B₅+0.1～0.3mg/L?NAA+0.5～1.5mg/L?6-BA+2.5%～3.5%蔗糖，pH值為5.4～5.8。

5.根據權利要求1所述的一種白背三七細胞懸浮培養體系的構建方法，其特征在于步驟（4）所述的條件為：接種密度為70～90g/L，裝液量為30～40%。