[發明專利]一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201510085590.7
• 申請日: 2015-02-16
• 公開（公告）號: CN104645325A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 王華瑞;李永亮
• 申請（專利權）人: 武漢思齊源生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16;C12N15/85
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 陳薇

技術領域

本發明屬于疫苗制備領域，尤其涉及一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法。

背景技術

禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亞型忠的一些毒株引起的急性呼吸道傳染病。動物禽流感的大規模爆發，不僅給養殖戶帶來嚴重損失，也危害到人類的身體健康，同時帶來了重大的經濟損失。

一般采用動物禽流感疫苗來預防與治療動物禽流感。

一方面，現有的技術中，一般選取滅活的毒株來制備疫苗。一般用雞胚生產，病毒適應雞胚后在雞胚中的生長，疫苗生產周期長。另外病毒在雞胚的傳代的過程中很容易發生變異，導致疫苗的免疫效果不好。很難達到有效預防的目的。

另一方面，現有的疫苗多采用注射的形式接種，接種復雜，易產生疼痛感，因此，研究一款能夠口服的疫苗具有重要意義。

發明內容

鑒于現有技術所存在的問題，提供一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，具有免疫效果好、服用方便等優點。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，包括以下步驟：

1)構建含有HA基因的重組質粒，將其轉染到表達細胞中，進行培養、表達；

2)將步驟1)表達的蛋白進行純化，獲得重組禽流感亞單位顆粒；

3)將步驟2)得到的重組禽流感亞單位顆粒凍干；

4)將步驟3)得到的凍干粉溶解于單磷酰脂質A和氫氧化鋁的混合溶液中，混合均勻，得到混合液；

5)將步驟4)得到的混合液，包裝，制劑、輻射滅菌，獲得重組禽流感亞單位口服疫苗。

進一步，所述凍干粉在混合溶液中的質量分數為1％。所述單磷酰脂質A在混合溶液中的質量分數為0.2％，所述氫氧化鋁在混合溶液中的質量分數為0.03％。

本發明的有益效果是：本發明所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，通過將凍干粉溶解于單磷酰脂質A和氫氧化鋁的混合溶液中，制成禽流感亞單位口服疫苗。不需要注射，緊緊通過口服就可以達到很好的免疫效果。

附圖說明

圖1為本發明所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗對小鼠的免疫效果圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

本發明所述的實驗方法若無特別說明均采用本領域的常規技術手段，可參見說明書或者分子生物學克隆指南第三版。本發明所使用的實驗試劑若無特別說明均為本領域的常規實際，市場上可以購買到。

實施例1培養病毒株A/Anhui/1/2013(H7N9),提取病毒株中的RNA

所述A/Anhui/1/2013(H7N9)來自中國疾控中心(CDC)。

將禽流感病毒株A/Anhui/1/2013(H7N9)取0.2mL接種于15日齡雞胚，37攝氏度培養40h，置于4攝氏度冰箱過夜，無菌收集尿囊液。取病毒尿囊液500mL4攝氏度條件下6000rpm離心20min收集上清,25000rpm離心2h超速離心，沉淀用5mLTEN重懸，用質量分數10％-40％的蔗糖梯度離心，35000rpm離心2h，收集質量分數30％-35％的病毒帶，透析脫糖，用無RNA酶的TE緩沖液懸浮，分裝，凍存。

利用QIANGEN?Rneasy?Mini?Kit試劑盒提取RNA，具體操作步驟參見說明書。

實施例2利用反轉錄PCR獲得cDNA

取RNA菌懸液10微升，加入20pmol引物1(如SEQ?ID?NO：3所示核酸序列)混勻后置于70攝氏度水浴中反應10min，再加入5*反轉錄酶緩沖液、0.1mol/LDTT2微升、2.5mmol/LdNTP?4微升、RNA酶抑制劑1微升、M-MLV反轉錄酶10U,37攝氏度水浴1h，97攝氏度作用10min。獲得cDNA。

實施例3以獲得的cDNA為模板，擴增HA基因

按照如下反應體系配置反應液：