[發明專利]利用黑曲霉全細胞轉化生產表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法

有效

• 申請號: 201510085412.4
• 申請日: 2015-02-15
• 公開（公告）號: CN104673845A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 方祥;章愛媛;劉文瑤
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12P17/06;C12R1/685
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明屬于生物工程與生物化學技術領域，特別涉及一種利用黑曲霉全細胞轉化生產表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法。

背景技術

茶飲料作為一種全球流行的植物飲料，其在抗癌和心血管等疾病的保健功效已經得到公認。目前認為，兒茶素是茶葉中的主要功能活性成分，含量占茶多酚總量的60～80％，包括表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子酸(GA)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)。茶葉中EGCG含量最高，占到茶葉干重的9～13％。茶多酚具有許多重要的保健功效，有很強的抗氧化活性和清除自由基的能力、抑制腫瘤細胞生長的抗癌作用、抗菌抗病毒活性和抑制脂肪積累的減肥功效等。

普洱茶作為一種后發酵茶，通過微生物發酵，茶葉兒茶素成分通過生物轉化，形成獨特的品質特性和功能特性。在普洱茶發酵過程中，兒茶素含量下降，EGCG和ECG等酯型兒茶素被完全降解，但普洱茶仍然表現出較強的抗癌、抗菌和降血脂降膽固醇等保健功效，說明普洱茶品質形成過程中，兒茶素被微生物分解轉化形成了新的功能性成分。事實上，喝茶后，茶多酚在消化道上段不能被分解利用，同時也很少被吸收。絕大多數茶多酚(超過90％)進入到結腸，被結腸微生物所分解后再被結腸吸收，然后進入系統循環起作用，一部分則被排出體外。因此，茶多酚的低生物可利用度與其功能特性形成悖論。如何提高茶多酚的生物可利用度近年來已成為業界關注的熱點。Macedo,JA?et?al研究發現，采用丹寧酶轉化茶多酚和EGCG后其抗氧化活性和抗癌活性均有明顯的增強。茶多酚體外轉化將在結腸中微生物的消化分解轉移到體外進行，相當于延長的動物消化道，可大大提高茶多酚的生物可利用度。

茶多酚體外轉化可選擇酶轉化的方式。東華大學采用米曲霉ATCC?20719菌株和黑曲霉ATCC?46890菌株制備表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯(EGCG)水解酶對EGCG進行降解獲得表沒食子酸兒茶素(EGC)和沒食子酸(GA)，兩種菌株制備酶液發酵過程均需要48-120h，米曲霉獲得的酶液需在40℃的反應體系中，處理24h完成轉化，而黑曲霉獲得的酶液需要在25-60℃，反應0-48h或直至水解反應結束方可停止。酶轉化成本較高，需購買酶制劑或自己制備酶液，工藝復雜。為降低成本，可直接采用微生物全細胞進行生物轉化，從發表的文獻來看，采用黑曲霉發酵轉化EGCG酶轉化效率最高為發酵時間為5d。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺點與不足，提供一種利用黑曲霉全細胞轉化生產表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種利用黑曲霉全細胞轉化生產表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法，采用黑曲霉(Aspergillus?niger)RAF106菌株進行全細胞生物轉化，全細胞生物轉化的營養液為含有茶多酚或EGCG質量百分含量1～20％的營養液。

所述的黑曲霉(Aspergillus?niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保藏編號為CGMCC?NO.9608，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏單位地址為中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號(100101)。

所述的黑曲霉(Aspergillus?niger)RAF106菌株具有以下生物學特性：菌落表面平坦，邊緣整齊，培養基背面呈乳白色，中間稍有乳黃色，基內菌絲發達。在25℃的察氏平板培養基上培養8d，RAF106菌落直徑為51.0±1.53mm，邊緣有少量白色絨毛狀氣生菌絲，菌落表面呈灰褐色，表面有小滴狀黑色滲透液(見圖2)。菌落形態不規則，表面褶皺狀，培養基背面呈黑褐色。

黑曲霉RAF106菌株rDNA-ITS全長堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。

所述的黑曲霉RAF106菌株應用種子培養基進行種子培養，獲得黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子；

所述的種子培養基的配方為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃滅菌20min。黑曲霉RAF106菌株的種子培養基也可使用市售的馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養基。

所述的種子培養的條件為：茄子瓶靜置培養，培養溫度28～35℃，培養時間3～5d。

在所述的種子培養過程中，黑曲霉RAF106菌株的種子菌接種量為每毫升全細胞生物轉化的營養液接種10²～10⁸個黑曲霉RAF106菌株分生孢子。