[發明專利]一種高產多糖小球藻種的分離方法

有效

• 申請號: 201510084371.7
• 申請日: 2015-02-15
• 公開（公告）號: CN105713837B
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 汪凡越
• 申請（專利權）人: 汪凡越
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及經濟微藻研究與開發應用，旨在提供一種分離高產多糖小球藻種的方法。該方法是在Basal培養液中加入甘油、鼠李糖和維生素C配制成高產多糖小球藻種的培養液HPSC?M；從野生鐵皮石斛莖上分離附生藻，并經高溫干燥環境下進行壓力篩選，獲得高產多糖的小球藻。本發明方法與傳統選育方法相比，具有操作簡便、成本低、對操作人員的專業技術無特殊要求、應用性強等優點，可為小球藻育種等提供必要的技術方法。

技術領域

本發明涉及經濟微藻研究與開發應用的技術，特別涉及高產多糖小球藻種的分離方法。

背景技術

小球藻(Chlorella)是一類分布廣、生長快，其在全球培植與應用規模最大的經濟微藻之一。多糖是小球藻的重要生物活性成分之一，具有調節機體免疫能力、抗腫瘤、抗病毒和抗衰老等顯著功效。但生物活性多糖一般都屬次生代謝產物，在生物體內的含量普遍較低、生產成本偏高，嚴重制約著其深入研究和進一步的推廣應用。邵斌等[高產多糖小球藻新品系選育及其對南美白對蝦的促生長和免疫調節作用.核農學報.2013，27(2)：167～172]利用誘發突變等技術育成了多糖含量達25.3％、比其親本高70.9％的高產多糖小球藻新品系Chl-ZN5-M2，并已實現規模化應用。為進一步降低小球藻多糖的生產成本、推進其商業化進程，迫切需要建立多糖含量更高的小球藻種的選育方法。

發明內容

本發明要解決的問題是，克服現有技術中的不足，目的是提供一種高產多糖小球藻種的分離方法。所述的高產多糖小球藻種，是指多糖含量比目前多糖含量最高達25.3％的小球藻種Chl-ZN5-M2[邵斌等.高產多糖小球藻新品系選育及其對南美白對蝦的促生長和免疫調節作用.核農學報.2013，27(2)：167～172]的至少高30％的小球藻種。

為解決技術問題，本發明的方案是：

提供一種高產多糖小球藻種的分離方法，包括以下步驟：

(1)在1L的Basal培養液[陳峰，姜悅 主編.微藻生物技術.中國輕工業出版社，1999，P 61]中，依次加入1.5ml甘油、2g鼠李糖、0.5g維生素C，充分攪拌溶解，配制成高產多糖小球藻種的培養液，記為HPSC-M；

(2)用浸蘸HPSC-M的棉簽輕拭野生新鮮鐵皮石斛莖上的藻斑，爾后將棉球放入盛有5ml HPSC-M的50ml燒杯中潤洗，重復輕拭-潤洗10次，直至燒杯中的藻液呈淡綠色，并用100目的尼龍篩絹過濾；

(3)將濾得的藻液置恒溫光照培養箱中培養，溫度30℃，光照60μmol·m^-2·s^-1，待藻液在分光光度計波長560nm處的光密度OD₅₆₀達0.8時，用HPSC-M稀釋使OD₅₆₀至0.2，在上述條件下繼續放大培養，如此反復，直至OD₅₆₀達0.8的藻液達100ml；

(4)將上述OD₅₆₀達0.8的藻液轉入高速離心機的離心管中以8000～12000rpm的轉速離心10-15min，小心傾去上清液后即得藻泥；

(5)將上述藻泥均勻涂于直徑為7cm的玻璃培養皿中，置于溫度為45℃、相對濕度RH為20％、光照強度60μmol·m^-2·s^-1的人工光照氣候箱中處理12d后，取出并用100ml的HPSC-M潤洗后轉入250ml的三角瓶中置于溫度30℃、光照60μmol·m^-2·s^-1的恒溫光照培養箱，過10d后發現變綠，取樣于顯微鏡下觀察發現野生鐵皮石斛附生藻中的部分藻能恢復生長；

(6)取5ml步驟(5)中恢復生長的藻液，用100目的尼龍篩絹過濾，濾液用HPSC-M稀釋至OD₅₆₀約為0.1；