[發(fā)明專利]雜交瘤細(xì)胞株Zj/2D8及其檢測尼克酰胺?N?甲基化酶抗原的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510084356.2
• 申請日: 2015-02-16
• 公開（公告）號: CN104894073B
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鈞;謝鑫友;楊肅文;王燕忠
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;G01N33/573
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蛋白免疫學(xué)檢測方法，具體涉及一種可以抗尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的細(xì)胞株、制備方法及該單克隆抗體的用途。

(二)背景技術(shù)

惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，每年全球癌癥新發(fā)病例1000多萬，死亡700多萬，占總死亡人數(shù)的12％。到2020年前，每年將新增1500萬癌癥患者，不僅如此，癌癥的死亡人數(shù)也在全球迅速上升，2030年這個數(shù)字可能會增至1320萬。

腫瘤的早期診斷是腫瘤防治的關(guān)鍵，腫瘤的死亡和復(fù)發(fā)的危險性與初診時的分期密切相關(guān)，且化療、放療的敏感性一定程度上取決于癌細(xì)胞內(nèi)的酶或蛋白分子。生物標(biāo)志物是細(xì)胞處于特定條件下代表該細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)的重要信號指示分子。為了降低腫瘤的死亡率或提高治療的效果，許多研究致力于腫瘤關(guān)鍵生物標(biāo)準(zhǔn)物的發(fā)現(xiàn)和篩選。因此，尋求腫瘤早期診斷、分期或/和指示化療、放療的敏感性、預(yù)后以及潛在治療靶點(diǎn)的腫瘤標(biāo)志物一直是腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。

尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2.1.1.1)正常表達(dá)于人肝臟組織中，其他組織如腸、肺、腎、胎盤、心臟、骨骼肌、腦、胰腺表達(dá)很低或者沒有表達(dá)。NNMT在不同人的肝臟中活性差異較大，活性的高低取決于胞漿中NNMT的濃度，NNMT的濃度與NNMT的mRNA水平有關(guān)，與基因的多態(tài)性無關(guān)，通常認(rèn)為NNMT過表達(dá)的機(jī)制是由于基因翻譯后調(diào)控異常所致，可能受肝細(xì)胞核因子-1(HNF-1)、TGF-β1、STAT3等激活。

NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)為供體，催化尼克酰胺和吡啶類物質(zhì)的甲基化，形成吡啶鹽，在正常肝細(xì)胞中參與藥物的生物轉(zhuǎn)化，是催化藥物、異型生物質(zhì)代謝的一種酶。NNMT是維持尼克酰胺平衡的關(guān)鍵酶，所以可以推測NNMT的增高可影響尼克酰胺參與細(xì)胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的組成部分，可通過補(bǔ)救合成途徑生產(chǎn)NAD，而NAD參與細(xì)胞的很多基本可能如能力代謝，對應(yīng)和損傷的抵抗，細(xì)胞的壽命等。帕金森綜合癥被認(rèn)為與NNMT增高引起的尼克酰胺代謝異常有關(guān)，在腦組織中該酶活性過度增高通過兩條途徑導(dǎo)致帕金森綜合癥，一是生成神經(jīng)毒物N-甲基吡啶(如N-甲基-4苯基吡啶(MPP+))激活導(dǎo)致線粒體復(fù)合體1受損，二是降低了尼克酰胺導(dǎo)致能量代謝障礙。尼克酰胺還能抑制多聚ADP聚合酶(PARP)，而PRAP通過堿基切除修復(fù)、壞死、凋亡等多細(xì)胞調(diào)節(jié)來保持基因組的完整性。因此有理由推測NNMT可能參與腫瘤細(xì)胞的多種生物功能，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，或可影響化，放療效果。如能明確NNMT在腫瘤細(xì)胞中的作用，并闡明NNMT在腫瘤中的作用機(jī)制或分析其下游相關(guān)分子組成的模塊或通路，必將進(jìn)一步明確NNMT作為在腫瘤防治中的價值。

近年來，用蛋白助學(xué)和基因芯片技術(shù)比較不同癌組織和癌旁組織差異時發(fā)現(xiàn)NNMT在多種癌組織中異常表達(dá)。與正常組織和癌旁組織相比，NNMT在結(jié)直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌、腎透明細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌和胰腺等腫瘤組織有過表達(dá)，并在多種腫瘤患者的血清中升高。這些研究提示NNMT與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，推測NNMT可能參與腫瘤細(xì)胞的多種生物功能，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，或可影響化、放療效果。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明采用尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作為免疫原免疫小鼠制備了能穩(wěn)定分泌抗NNMT單克隆抗體的細(xì)胞株，然后通過NNMT蛋白的間接ELISA法篩選并進(jìn)一步純化獲得了能分泌NNMT抗體的細(xì)胞系及由所屬細(xì)胞系提取的單克隆抗體，因此本發(fā)明目的是提供一株高效分泌抗NNMT(尼克酰胺-N-甲基化酶)抗體的雜交瘤細(xì)胞株，利用該細(xì)胞株提取NNMT抗體，采用NNMT抗體對待測組織中的NNMT抗原進(jìn)行檢測，進(jìn)而確定待測組織中NNMT抗原的含量，有助于臨床診斷。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一株雜交瘤細(xì)胞株Zj/2D8，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年10月22日，保藏編號為CCTCC NO：C2013149，保藏地址為中國武漢，武漢大學(xué)，郵編：430072。

本發(fā)明還涉及一種所述雜交瘤細(xì)胞株Zj/2D8在檢測尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT)抗原中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用是提取雜交瘤細(xì)胞株Zj/2D8中的NNMT抗體，再根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合原理，利用NNMT抗體檢測待測樣品中NNMT抗原含量。