[發明專利]一種重組乙?；栯x子型胰蛋白酶的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201510083691.0
• 申請日: 2015-02-16
• 公開（公告）號: CN104694522B
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 趙明治;徐平;吳飛林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C12N15/70;C12N9/96
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

本發明公開了一種重組乙?；栯x子型胰蛋白酶的制備方法及其應用。采用本發明的制備方法制備的重組陽離子型豬胰蛋白酶和重組乙?；栯x子型豬胰蛋白酶具有高的酶活力，重組陽離子型豬胰蛋白酶的酶活力為27800BAEE單位/mg酶；重組乙?；栯x子型豬胰蛋白酶的酶活力為30200BAEE單位/mg酶；商品化豬胰蛋白酶的酶活力為9600BAEE單位/mg酶。本發明的制備方法具有酶產量高、特異性好、無動物來源病毒等有優點，生產與制備工藝簡單、成本低，可以應用于生物制藥和蛋白質組學研究。

技術領域

本發明涉及基因工程領域中一種重組乙酰化陽離子型胰蛋白酶的制備方法及其應用。

背景技術

胰蛋白酶(EC3.4.21.4)，是一種絲氨酸蛋白酶，在脊椎動物和無脊椎動物中廣泛存在。在脊椎動物的胰臟中，胰蛋白酶以無活性的酶原(胰蛋白酶原)形式表達，經活化后形成胰蛋白酶。該酶可特異性的在蛋白質底物的賴氨酸和精氨酸的羧基端進行酶切水解，不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。胰蛋白酶在臨床上可用于抗炎消腫，在工業上可用于皮革制造、生絲處理、食品加工等。此外還常用于動物細胞培養前對組織的處理和蛋白組學研究。

激活的胰蛋白酶被稱為β-胰蛋白酶。β-胰蛋白酶可進一步地激活更多的酶原。β-胰蛋白酶除了可以對底物蛋白進行酶切外，也可以發生自消化。比較典型的是在Lys131-Ser132之間發生自切而產生α-胰蛋白酶。α-胰蛋白酶通過分子內二硫鍵繼續維持完整的胰蛋白酶分子形態，但是其活性顯著降低。另外，來源于胰臟的胰蛋白酶中還含有胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)。胰凝乳蛋白酶在胰蛋白酶的純化中很難被完全去除，使得動物來源的胰蛋白酶具有了非特異性酶切的活性。為克服這種非特異的酶切活性，發展了TPCK處理方法，可淬滅純化的胰蛋白酶產物中的胰凝乳蛋白酶活性。

在生物制藥領域，病毒去除是整個生物制藥工藝中非常關鍵的步驟。這使得對動物來源的原材料要求非常嚴格，極大地限制了動物來源的胰蛋白酶的應用。尋求可生產高活性、特異性強并且無動物來源病毒風險的胰蛋白酶的方法是目前亟待解決的問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何制備高產量、高活性、高特異性和無動物來源病毒的胰蛋白酶并在此基礎上對該胰蛋白酶進行乙?；揎棲@得更穩定的乙?；a品。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了制備胰蛋白酶的方法。

本發明所提供的制備胰蛋白酶的方法，包括向受體大腸桿菌細胞中導入氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的胰蛋白酶原的編碼基因，得到重組大腸桿菌細胞。對所述重組大腸桿菌細胞進行IPTG誘導，啟動胰蛋白酶原基因的表達。收集所述重組大腸桿菌細胞，破碎所述重組大腸桿菌細胞，得到包涵體。對所述包涵體進行變性，得到變性后的樣品；將所述變性后的樣品進行復性，得到復性后的樣品；將所述復性后的樣品進行第一次純化，得到純化后的胰蛋白酶原；將所述純化后的胰蛋白酶原進行激活，得到激活的胰蛋白酶；將所述激活的胰蛋白酶進行第二次純化，得到純化后的胰蛋白酶；

所述復性在復性緩沖液中進行。所述復性緩沖液的pH值可為7.0-9.0，具體可為7.5；所述復性緩沖液由溶劑和溶質組成，所述溶劑為水，所述溶質為三羥甲基氨基甲烷、尿素、胱氨酸和半胱氨酸；所述三羥甲基氨基甲烷在所述復性緩沖液中的濃度可為10-50mM，具體可為20mM；所述尿素在所述復性緩沖液中的濃度可為1-2M，具體可為2M；所述胱氨酸在所述復性緩沖液中的濃度可為1-2mM，具體可為1mM；所述半胱氨酸在所述復性緩沖液中的濃度可為3-5mM，具體可為3mM。