[發(fā)明專利]一種外周血單個(gè)核細(xì)胞無血清凍存液及凍存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510083493.4
• 申請(qǐng)日: 2015-02-13
• 公開（公告）號(hào): CN104719282B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛嘯虎;陳海佳;王一飛;戴國勝;王小燕;羅二梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 廣州圣理華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司44302
• 代理人: 頓海舟,陳業(yè)勝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞凍存液技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種外周血單個(gè)核細(xì)胞無血清凍存液及凍存方法。

背景技術(shù)

外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral?blood?mononuclear?cell，PBMC)，指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞(monocyte)、樹突狀細(xì)胞和造血干細(xì)胞等。PBMC在體外可誘導(dǎo)分化成多種免疫細(xì)胞，如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)、自然殺傷細(xì)胞(NK)、自然殺傷性T細(xì)胞(NKT)，在抗腫瘤、抗感染等方面具有重大用途。因此，凍存PBMC在細(xì)胞治療方面具有很重要的意義。

細(xì)胞凍存是細(xì)胞長期保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。

目前，細(xì)胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。目前最常用的凍存保護(hù)劑為二甲基亞砜(DMSO)，這種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，減少胞內(nèi)形成冰晶的機(jī)會(huì)，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。由于高濃度DMSO對(duì)細(xì)胞有毒性，還必須添加其他的液體成分，如血清、細(xì)胞培養(yǎng)基，以降低DMSO的濃度，減少對(duì)細(xì)胞的傷害。

現(xiàn)有PBMC凍存液主要以DMSO為主，聯(lián)合胎牛血清(FBS)或人血清(HAS)，并添加細(xì)胞培養(yǎng)基。血清可保護(hù)PBMC免于遭受凍存、復(fù)蘇的損傷。比如，王桂喜等比較DMSO10％+FBS90％、DMSO10％+右旋糖酐40(Dextran-40)10％+FBS80％、DMSO10％+(羥乙基淀粉)HES?6％+FBS?84％等凍存液配方對(duì)對(duì)PBMC的保護(hù)作用，結(jié)果顯示DMSO10％+Dextran-4010％+FBS80％的凍存效果最好，PBMC復(fù)蘇后活率最高，為79.7±1.5％。Robab?Nazarpour等研究發(fā)現(xiàn)，10％～15％DMSO+40％FBS凍存PBMC效果較好。此外，公開號(hào)為CN102669087A的中國發(fā)明專利申請(qǐng)，公開了一種外周血單個(gè)核細(xì)胞凍存液，包含滲透性冷凍保護(hù)劑、β-葡聚糖、血清或血漿、生理鹽水。此外，細(xì)胞培養(yǎng)基也是凍存液的常用組分，比如覃春捷等用以RPMI?1640培養(yǎng)基和DMSO、10％白蛋白作凍存保護(hù)劑在-80℃條件下直接凍存外周造血干細(xì)胞。

現(xiàn)有技術(shù)中干細(xì)胞凍存液所使用的胎牛血清常攜帶動(dòng)物源性病毒，比如歐洲多個(gè)國家發(fā)生瘋牛病，其血清中含有導(dǎo)致瘋牛病的病毒，用于凍存細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致此類病毒傳播。此外，有研究表明長期與胎牛血清接觸的干細(xì)胞會(huì)對(duì)溶液介質(zhì)中的胎牛血清發(fā)生內(nèi)吞，內(nèi)吞胎牛血清后的干細(xì)胞有可能發(fā)生某些蛋白表達(dá)的變化，應(yīng)用于人體后有可能發(fā)生異種動(dòng)物蛋白引起的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致干細(xì)胞移植后成功率降低以及不良反應(yīng)的發(fā)生。而人血清亦可傳播潛在的病毒，比如乙肝病毒，艾滋病毒等。因此，中國藥品和食品質(zhì)量監(jiān)督管理局2003年發(fā)布的《人體細(xì)胞治療臨床研究和質(zhì)量控制指導(dǎo)原則》明確指出，應(yīng)盡量避免使用血清培養(yǎng)細(xì)胞，包括動(dòng)物血清和人血清。

為了避免使用血清帶來病毒感染，有些人使用了人血白蛋白，但人血蛋白在臨床上可能引起一些不良反應(yīng)，比如過敏性休克、發(fā)熱、心臟損害、呼吸系統(tǒng)損害、腎臟損害等，這限制了含有白蛋白的細(xì)胞凍存液在臨床上直接使用的安全性。

另外，現(xiàn)有的凍存液配方中含有細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)基不能直接注射入人體，故如果需要細(xì)胞復(fù)蘇后直接移植，則必需通過離心把細(xì)胞培養(yǎng)基去除掉，而離心又會(huì)導(dǎo)致剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞受損，活率降低，影響細(xì)胞治療效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種外周血單個(gè)核細(xì)胞無血清凍存液，該凍存液由DMSO、右旋糖酐40、勃脈力A組成，不含動(dòng)物血清、人血清、細(xì)胞培養(yǎng)基，且凍存效果良好，細(xì)胞復(fù)蘇后既可直接用于臨床，又可在體外誘導(dǎo)成免疫細(xì)胞NKT、CIK，在臨床上頗具應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明具體的技術(shù)方案如下：

一種外周血單個(gè)核細(xì)胞無血清凍存液，其特征在于，按體積分?jǐn)?shù)計(jì)包括以下組分：5～20％的二甲基亞砜、0.5～10％右旋糖酐40，余量為勃脈力A。

其中勃脈力A為中國藥監(jiān)局批準(zhǔn)用于臨床的復(fù)方電解質(zhì)注射液，其組分為：每1000ml含氯化鈉5.26g、葡萄糖酸鈉5.02g、醋酸鈉3.68g、氯化鉀0.37g、氯化鎂0.30g。

本發(fā)明的目的還可以通過以下方案實(shí)現(xiàn)：