[發明專利]生物膜蛋白質的提取方法和電泳樣品的制備方法

有效

• 申請號: 201510083007.9
• 申請日: 2015-02-16
• 公開（公告）號: CN104697831B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 邢美燕;徐婷;王寅;卞方杰;潘賽;孫文;楊健;吳敏;王亞宜
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司31002
• 代理人: 吳林松

技術領域

本發明屬于生物處理技術領域，涉及一種生物膜蛋白質的提取方法和電泳樣品的制備方法。

背景技術

許多研究證明，通過傳統的分離培養方法鑒定的微生物只占天然環境微生物總數的1％。近年來，新興的宏蛋白質組學是一種運用蛋白質組技術對特定微生物群落所產生的全部蛋白質進行大規模研究與分析的新技術，也是一種探索微生物群落結構的新策略。通過宏蛋白質組研究能夠把微生物群落組成與其生態功能聯系起來，從而更好地了解系統中的功能微生物。

隨著對微生物和環境微生物的宏基因的測序研究的不斷深入和發展，對基因表達蛋白質的研究更加重要。盡管宏基因組學研究能夠提供很多有價值的數據，其弊端也顯現出來：，比如，由于重復基因的出現和基因表達的時空性等原因，造成了微生物的基因表達不能通過宏基因組的研究來解釋。此外，微生物對物質的轉化主要是通過其分泌的酶來實現的。眾所周知，大多數酶的化學本質是蛋白質，因此，在基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組這4個研究層次中，蛋白質組學是最直接的對特定環境和特定時刻生物功能本質的研究，這種研究具有較大的生物學意義。盡管現在只開展了少數的宏蛋白質組學研究，但是其在環境微生物研究中的巨大作用已經顯現出來。

Wilmes.P.等人在生物強化除磷系統中鑒定出了702個與A.phosphatis有關的蛋白點，并指出在好氧和厭氧環境下，僅有3％的蛋白表達產生顯著差別。Lv.F.等人研究纖維素的厭氧消化處理時發現微生物能夠對纖維素進行劇烈水解作用，并且檢測到了分子生物技術未能檢出的具有纖維素分解功能的微生物。Kan等人對Chesapeake海灣海水微生物群落進行研究通過2D電泳發現該海灣不同水域蛋白質組存在較大差異，通過對有表達差異的7種蛋白質譜分析，鑒定出4種新的蛋白質。因此，微生物的蛋白表達是隨著時間和空間的變化而變化的動態信息，能夠更加直接具體地給出關于微生物活性方面的信息，因而宏蛋白質組學在微生物群落功能分析、代謝與環境相互作用過程中具有更大的潛力。

進行宏蛋白質組學分析的關鍵步驟是實現對樣品中蛋白質的有效提取。Taylor等模擬天然環境，對培養的微生物樣品進行了兩種提取方法的比較。結果顯示直接提取法的蛋白質SDS-PAGE圖像模糊不可辨，而且蛋白質回收率很低；DGC-EXT提取法的SDS-PAGE圖像有6～10條帶，說明先收集細胞再提取蛋白法(DGCEXT提取法)優于直接提取法。Wilmes.P.等對活性污泥的蛋白質提取進行了不同細胞破碎法、不同洗滌及裂解緩沖液、不同蛋白沉淀及溶解方法對蛋白提取效果的影響的研究，最終確定了一種適合活性污泥的總蛋白提取方法。Kuhn.R.等人采用了酚提法來提取MBR反應器中活性污泥的蛋白質。苯酚對其中的腐殖質有一定的萃取作用，并對粗提液進行了多次醋酸銨沉淀最終獲得了可用于2D電泳分析的蛋白質溶液。由于環境樣品的復雜性，目前仍然沒有通用的適用于提純各種環境下微生物總蛋白的方法，尤其是從生物膜或活性污泥等環境中提取蛋白還是有很多的困難。

對污水污泥處理中微生物的宏蛋白質組學主要集中于活性污泥。然而，在自然環境下，與活性污泥系統相比，生物膜也是個復雜的生態系統，諸多因素共同影響著污染物的遷移、轉化以及微生物的群落結構，目前，對于生物膜系統的研究大都是在實驗室可控條件下開展的，需要預先培養或者富集特定微生物。另外，生物膜是復雜的微生物聚集體，食物鏈長，腐殖化程度明顯，生物膜中各種微生物以附著形式生長，在濾料表面繁殖形成致密的生物膜，其結構與微生物種類往往比活性污泥菌膠團更加復雜和多樣。而且在生物膜老化的過程中產生的腐殖質會與微生物釋放和分泌的蛋白質結合，難以分離導致樣品提純難度大，是這一研究中存在的最大困難。加上蛋白質技術又沒有類似于PCR的擴增手段等，對于蛋白質含量低的樣品分析更加困難。現有的各種蛋白質提取方法運用于生物膜效果都不盡人意，目前還沒有一種提取生物膜總蛋白質的通用有效的方法，這也是導致宏蛋白質組學在環境研究方面的遲滯最重要原因。

目前被宏蛋白質組研究者廣泛使用的由Wilmes.P.建立的方法，發明人重復該方法提取生物膜的蛋白質，沒有獲得理想的效果，表明該方法缺乏較好的通用性。因此提出了新的高效、通用的蛋白質提取方法對宏蛋白質組學研究與應用至關重要。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的主要目的在于提供一種生物膜蛋白質的提取方法，該種方法能夠對來自于生物膜的蛋白質進行有效提取，其無需對特定的微生物進行預先培養或者富集，同時也能夠降低腐殖質對蛋白質的掩蔽作用，使蛋白質能夠很好地與腐殖質相脫離。