[發明專利]斑節對蝦MAT1基因及其編碼的蛋白

在審

• 申請號: 201510082851.X
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104611342A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 邱麗華;傅明駿;趙超;王艷;江世貴;周發林
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/46;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 高東陽

技術領域

本發明公開了斑節對蝦MAT1基因及其編碼的氨基序列，分析了其在不同組織中及不同發育時相卵巢中的表達分布情況；屬于生物基因技術領域。

背景技術

細胞周期調控是一個精確調控的過程。在細胞分裂過程中真核生物的細胞周期可以概括為兩個大的階段：細胞分裂間期(即G1時期、S時期和G2時期)和細胞分裂期(即M時期)，在細胞分裂時期，需要許多周期蛋白參與調控以保證其精確性，CAK(周期蛋白依賴性激酶的激酶)作為CDK激活重要參與因子，在細胞周期調控過程中扮演重要角色。

MAT1做為CAK的重要組成部分，對CAK的活性起著“分子開關”的作用，在調節信號分子轉導、控制細胞周期的進程、影響細胞的增殖和凋亡等方面起著關鍵作用。MAT1是CAK的靶向亞單位，通過調節CAK的活性，影響CDK1、CDK2、CDK4、RNA?PolⅡ和細胞周期蛋白等底物的磷酸化，進而影響抑癌基因p53、pRb的磷酸化及總轉錄因子TFIIH和RNA聚合酶II介導的轉錄過程,從而可以實現對卵巢發育的調控。

氨基酸序列是組成蛋白質三級結構、研究蛋白質功能的基礎，對于研究該蛋白在生長發育過程中的作用具有重要意義。

長期以來，斑節對蝦親蝦的人工繁育問題一直都是限制斑節對蝦養殖產業發展的技術瓶頸。在實際生產過程中，親蝦的性腺成熟參差不齊，難以集中育苗的問題是對蝦養殖過程中一個非常重要的限制因素。眼柄切除手術作為促進親蝦性腺同步成熟的常用方法，對親蝦本身存在非常大破壞性，導致了親蝦較高的死亡率和產卵質量低等問題，不利于可持續養殖，加大了養殖成本。因此出于尋求一種新的對蝦繁育方法的需求，對對蝦卵巢發育機理及其分子調控機理進行研究勢在必行。

發明內容

本發明的是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎設計的PCR擴增引物，并通過RACE技術克隆到斑節對蝦MAT1基因的全表達序列，該序列用于分析斑節對蝦生長發育的機制，從而可以從卵巢的發育機制中尋找替代剪除單側眼柄的方式來促進卵巢成熟的方法，提高親蝦的產卵率及其卵的質量，降低其死亡率。

本發明提供的斑節對蝦MAT1基因，該基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。

該基因的制備方法依次包括下述步驟：

1、總RNA的提取

取健康斑節對蝦，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃等組織，并分別將組織于1mL?Trizol(Invitrogen，日本)中勻漿，按Trizol試劑盒使用手冊提取斑節對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一鏈的合成

取上述斑節對蝦總RNA?2μL與反轉錄引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反轉錄酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一鏈，反應條件：42℃60min，70℃15min。

3、引物設計依據，引物合成的方法

根據已有的MAT1的EST序列設計引物：

引物設計后提交上海英駿生物技術有限公司進行合成。

4、斑節對蝦MAT1的PCR擴增、克隆

以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增技術對目的基因的3ˊ末端進行PCR擴增。

在3ˊRACE中，利用降落PCR方法，用接頭引物(Adaptor?primer：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3)和mat1-F1、mat1-F2進行PCR擴增。

所得到的PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，提交上海英駿生物技術有限公司進行測序。

5、對斑節對蝦MAT1基因的測定

所得到的PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序。測序結果用BLAST軟件進行同源性測定，來確定為斑節對蝦細胞MAT1基因同源序列。

6、斑節對蝦MAT1的分布和表達