[發(fā)明專利]斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白T基因及其編碼的蛋白

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510082501.3
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104630231A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邱麗華;傅明駿;趙超;郭松;江世貴;周發(fā)林
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 高東陽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白T及其編碼的蛋白的氨基序列，屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

細胞周期調(diào)控是一個精確調(diào)控的過程。在細胞分裂過程中真核生物的細胞周期可以概括為兩個大的階段：細胞分裂間期(即G1時期、S時期和G2時期)和細胞分裂期(即M時期)，在細胞分裂時期，需要許多周期蛋白參與調(diào)控以保證其精確性。

細胞周期蛋白T(Cyclin?T)是細胞轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控因子，和細胞周期蛋白依賴性激酶9(cyclin?dependent?kinase?9，CDK9)等組成正性轉(zhuǎn)錄延長因子b(positive?transcription?elongation?factor?b，P-TEFb)參與細胞轉(zhuǎn)錄延伸反應(yīng)的正性調(diào)控。Cyclin?T和CDK9組成的P-TEFb協(xié)同CDK8、cyclin?C、cyclin?K、RNA聚合酶II(POLR2A)、負(fù)性調(diào)控因子(DSIF、NELF)等共同調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄，保證細胞功能的正常發(fā)揮。目前已知的cyclin家族成員以A-J進行編號，共有約15種，其中cyclin?T作為轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控因子，在艾滋病、心肌肥大、腫瘤等疾病中有較深入的研究。Cyclins不僅是CDKs的激活亞基，而且是復(fù)合體(cyclins/CDKs)與其他基團或者調(diào)節(jié)因子直接作用時的識別效應(yīng)器。1995年，人們首先從果蠅中分離純化出P-TEFb，通過實驗進一步確認(rèn)了其成分主要是cyclin?T和CDK9等。近幾年的研究表明，cyclin?T是胚胎正常發(fā)育、細胞生長與分化以及艾滋病病毒(HIV-1)轉(zhuǎn)錄復(fù)制等過程必不可少的關(guān)鍵因子之一，其功能和作用機理是目前研究的熱點。隨著細胞周期蛋白研究的不斷廣泛和深入，cyclin?T在一些物種中相繼被克隆出來，如人(Homo?sapiens，AAC39638.1)、小鼠(Mus?musculus，AAD17205.1)、果蠅(Drosophila?melanogaster，AAC73052.1)、斑馬魚(Danio?rerio，XP_005167592.1)和印度跳蟻(Harpegnathos?saltator，EFN77646.1)等，但該基因在對蝦中尚未研究。

斑節(jié)對蝦是世界三大對蝦養(yǎng)殖品種之一，人工育種過程中廣泛采用的剪除單側(cè)眼柄催熟卵巢的技術(shù)會導(dǎo)致親蝦的高死亡率和產(chǎn)卵質(zhì)量低等問題。人們對于卵巢成熟促進因子(Mature?Promoting?Factor，MPF，cyclin?B/CDC2)的研究揭示細胞周期蛋白在對蝦卵巢發(fā)育中具有重要的潛在研究價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計的PCR擴增引物，并通過RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白T基因的全表達序列；此外通過斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白T基因設(shè)計熒光定量PCR引物，對周期蛋白T在斑節(jié)對蝦卵巢各個發(fā)育時相的分布情況及在不同組織中的分布情況進行研究分析，為研究斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白T在卵巢發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)，而且可以為斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖過程中所出現(xiàn)的性腺發(fā)育參差不齊的情況從分子層面提供理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白T基因，該基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。

該基因的制備方法依次包括下述步驟：

1、總RNA的提取

取健康斑節(jié)對蝦，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃等組織，并分別將組織于1mL?Trizol(Invitrogen，日本)中勻漿，按Trizol試劑盒使用手冊提取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。

2、cDNA第一鏈的合成

取上述斑節(jié)對蝦總RNA?2μL與反轉(zhuǎn)錄引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一鏈，反應(yīng)條件：42℃60min，70℃15min。

3、斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白T的PCR擴增、克隆