[發明專利]一種葡萄糖耐受的纖維寡糖酶的應用

在審

• 申請號: 201510080021.3
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104673857A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 盧雪梅;張聰;張為燦
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/02
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及來源于哈氏嗜纖維菌(Cytophaga?hutchinsonii)的一種葡萄糖耐受的纖維寡糖酶的應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

纖維素是由D-葡萄糖殘基通過β-1,4糖苷鍵連接形成纖維素鏈，纖維素鏈又通過氫鍵締合形成不溶于水的纖維素束。纖維素作為植物通過光合作用形成的主要生物質，是植物細胞壁的主要組成成分，成為地球上最豐富的可再生資源。在當今資源能源日益枯竭的社會中，充分利用這些生物質資源，將其轉化成為人類可以利用的能源和各種化工產品等，對于人類社會的可持續發展具有重要意義。

由于其高度有序的晶體結構，纖維素很不容易被降解。在自然環境中纖維素主要被微生物產生的纖維素酶降解。微生物產生的纖維素酶主要包括纖維素內切酶(endo-glucannase)，纖維素外切酶(exo-glucanase)以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。其中纖維素內切酶包括典型的內切酶和進行性內切酶，可以攻擊非結晶區的纖維素鏈，產生較短的糖鏈，并為外切酶提供更多的攻擊位點，進行性內切酶在打開非結晶區的β-1,4糖苷鍵后可以持續作用于糖鏈產生纖維寡糖或者纖維二糖。纖維素外切酶包括纖維二糖水解酶和纖維寡糖酶，可以持續作用于纖維素鏈產生纖維二糖或是葡萄糖。β-葡萄糖苷酶則可以水解纖維二糖水解酶的產物，纖維二糖，為底物產生葡萄糖進而被微生物代謝利用。有的微生物則能產生纖維寡糖酶(cellodextrinase)，水解纖維寡糖生成葡萄糖。

真菌產生纖維素酶多為胞外酶，具有比較容易分離純化等特點，現在工業用纖維素酶多為真菌纖維素酶。而細菌纖維素酶更容易在現在已經比較成熟的大腸桿菌表達系統中進行異源表達以及純化，具有很大的應用空間，因而對于高效細菌纖維素酶的發掘顯得尤為重要。

β-葡萄糖苷酶和纖維寡糖酶可以將纖維寡糖轉化成葡萄糖，是纖維素徹底降解的重要環節，但是其活性受到其產物葡萄糖的反饋抑制，因此難以大量積累葡萄糖，在工業應用中受到很大限制，尋找具有葡萄糖耐受特性的β-葡萄糖苷酶和纖維寡糖酶具有重要實際意義。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種葡萄糖耐受的纖維寡糖酶的應用。

一種葡萄糖耐受的纖維寡糖酶CHU_2268在降解纖維素中的應用，所述葡萄糖耐受的纖維寡糖酶CHU_2268的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

優選的，上述葡萄糖耐受的纖維寡糖酶CHU_2268降解纖維寡糖和纖維二糖。

葡萄糖耐受的纖維寡糖酶CHU_2268為一個GH3家族的糖苷水解酶，可以降解纖維寡糖和纖維二糖，終產物都為葡萄糖，在葡萄糖濃度較高的環境中也可以表現出相對較高的活力，該酶可以和纖維素內切酶共同作用將纖維素轉化為葡萄糖。

有益效果

本發明所述葡萄糖耐受的纖維寡糖酶CHU_2268比較容易在大腸桿菌E.coli中實現異源表達，獲得具有纖維寡糖酶活性的蛋白，有效地解決了哈氏菌生長周期長，酶成分比較復雜，產量較低，不容易分離純化的問題。該酶可以降解包括纖維二糖在內的纖維寡糖產生葡萄糖,而且具有較高的葡萄糖耐受性，在生物能源等工業中具有比較大的應用潛力。

附圖說明

圖1、葡萄糖耐受的纖維寡糖酶CHU_2268SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

其中：泳道1、誘導工程菌后超聲破碎得到的粗蛋白；泳道2、純化后的純化后的纖維寡糖酶CHU_2268；泳道M、marker，分子量為圖中所示，單位為KD；

圖2、以pNPG為底物的纖維寡糖酶CHU_2268的最適反應曲線圖；

其中：a、最適反應溫度曲線，b、最適反應pH曲線；

圖3、纖維寡糖酶CHU_2268降解pNPG以及pNPC產物的電泳圖；

其中：泳道M、marker，所用標準品如圖示；泳道1、纖維寡糖酶CHU_2268降解pNPG產物；泳道2、pNPG與滅活纖維寡糖酶CHU_2268共同孵育的pNPG對照；泳道3、纖維寡糖酶CHU_2268降解pNPC產物；泳道4、pNPC與滅活纖維寡糖酶CHU_2268共同孵育的pNPC對照；

圖4、纖維寡糖酶CHU_2268降解纖維二糖以及纖維寡糖產物的電泳圖；