[發明專利]一種魚類凝集素的抗菌應用

在審

• 申請號: 201510078492.0
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104984328A
• 公開（公告）日: 2015-10-21
• 發明（設計）人: 孫黎;劉莉
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A61K38/36
• 分類號: A61K38/36;A61P31/04;C12N15/70;C12N15/12
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體的說是一種魚類凝集素的殺菌和抗菌應用。

背景技術

凝集素(lectin)是自然界廣泛存在的一大類非免疫來源的、無酶活性的多價糖類結合蛋白,能使細胞發生凝集。凝集素結合的糖主要有甘露糖、葡萄糖和半乳糖。凝集素與糖以非共價鍵結合，結合力弱而且可逆，與酶和底物或抗原-抗體的反應類似。凝集素與互補大分子形成沉淀或使細胞凝集，所以每一個凝集素分子必須至少具有二個結合糖的位點，每一個位點適合一個糖或一個寡糖的幾個糖單元的互補分子。凝集素主要由肝臟合成，某些凝集素可以通過結合病原微生物表面的糖基配體而介導巨噬細胞調理吞噬作用和/或通過凝集素途徑激活補體,在機體的天然免疫防御中發揮重要作用。

發明內容

本發明目的在于提供一種魚類(半滑舌鰨)凝集素的抗菌應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種魚類凝集素的抗菌應用，凝集素用于制備殺菌或抗細菌感染的抑制劑。

所述凝集素用于制備魚類殺菌或抗細菌感染的抑制劑。

所述細菌為哈氏弧菌；魚類指半滑舌鰨。

所述凝集素為凝集素重組蛋白。

所述凝集素重組蛋白為經凝集素在大腸桿菌中表達獲得重組蛋白。

所述重組凝集素蛋白為以半滑舌鰨cDNA為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增,PCR產物經過與載體pBS-T連接轉換后與載體pET259連接，獲得質粒pEtP113A，轉化大腸桿菌BL21(DE3)即可表達重組凝集素。

本發明具有如下優點：本發明的凝集素能夠殺死魚類病原菌。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的純化的凝集素重組蛋白。其中，泳道1，分子量標準；泳道2,凝集素。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。

實施例1

凝集素P113A的重組蛋白的制備

1)表達凝集素P113A重組蛋白的質粒pEtP113A的構建：

本發明中的凝集素P113A的序列已報道(GenBank?access?ion?numberXP_008316312.1)。凝集素P113A具有典型的甘露糖結合域(氨基酸30-38)。pEtP113A的構建如下：以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增。PCR條件為：94℃?60s預變性模板DNA,然后94℃40s,53℃?60s,72℃?60s,5個循環后改為94℃?40s,59℃?60s,72℃?60s,30個循環。PCR產物用天根DNA產物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室溫連接2－4小時，連接混合液轉化到大腸桿菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml?5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固體培養基上培養18－24小時，挑出白色轉化子，提取質粒，命名為質粒pBSP113A。將表達載體pET259(pET259構建過程參見Hu?YH,Zheng?WW,Sun?L.Ident?ificat?ion?and?molecular?analys?is?of?a?ferrit?in?subunit?from?red?drum(Sciaenops?ocellatus).Fish?Shel?lfish?Immunol?2010；28:678-86)用限制性內切酶SwaI酶切后回收5.3kb，同時將pBSP113A用EcoRV酶切回收0.3kb片段。將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2－4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5a，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培養基上培養18－24小時,篩選轉化子提取質粒，即為pEtP113A。DNA測序表明pEtP113A含有編碼凝集素P113A序列的基因。

所述LB組成成分按重量百分比計：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化鈉,97.5％蒸餾水。所述F1為5’-GATATCATGAACCAGAACTCACTCAG-3’；R1為5’-GATATCTTTTTTTTCAGCAGCCCA-3’。

2)重組凝集素蛋白的誘導表達和純化