[發明專利]可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌及利用其制備乙酰酯酶的方法

有效

• 申請號: 201510077815.4
• 申請日: 2015-05-03
• 公開（公告）號: CN104762245B
• 公開（公告）日: 2018-09-11
• 發明（設計）人: 陳玉香;吳志偉;佟金;徐立新;王慶洲;張東光;馬麗娜;許田慧
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/18;C12R1/19
• 代理公司: 長春市四環專利事務所(普通合伙) 22103
• 代理人: 張建成

1.一種可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌，其特征在于：該大腸埃希氏菌為大腸埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC10507，其重組載體為pKK223-3-ybaC。

2.根據權利要求1所述的一種可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌，其特征在于：所述重組載體pKK223-3-ybaC的原始表達載體為pKK223-3。

3.根據權利要求1所述的一種可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌，其特征在于：所述的重組載體pKK223-3-ybaC轉入有ybaC基因。

4.根據權利要求1所述的一種可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌，其特征在于：可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌可在IPTG誘導下好氧發酵制備乙酰酯酶。

5.根據權利要求1所述的一種可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌，其特征在于：可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌的受體菌為大腸埃希氏菌JM110。

6.一種權利要求1所述可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌，其是由下述方法獲得：

(1)、大腸埃希氏菌RB3菌株總DNA的提取：將大腸埃希氏菌RB3菌株接種于30mL LB液體培養基中，37℃過夜培養，取菌液；采用細菌總DNA快速提取試劑盒提取大腸埃希氏菌RB3基因組DNA；

所述的大腸埃希氏菌RB3菌株為于牛瘤胃液中篩選得到；

所述的LB液體培養基構成如下：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，加水定容至1000mL；

(2)、ybaC基因的克隆：根據已公開的ybaC序列設計引物，并在上下游引物的5’端分別引入酶切位點EcoRI和PstI；以大腸埃希氏菌RB3總DNA為模板，進行PCR，得到ybaC基因的克隆；

所述的已公開的ybaC序列參照：GenBank KM489072；

所述的引物為：

ybaC-F 5’-CGGAATTCATGAAGCCGGAAAACAAATTAC-3’

ybaC-R 5’-AACTGCAGGCCGCGTATCGCTAAAGCT-3’

(3)、克隆載體pMD18-T-ybaC的構建：將電泳純化后的PCR產物，按適當比例與線性化的克隆載體pMD18-T混合，使用TaKaRa DNALigation Kit試劑盒進行pMD18-T載體和ybaC基因的連接，連接后轉化大腸埃希氏菌JM109，并進行陽性鑒定，將陽性單菌落插入片段測序；

所述的PCR產物純化是使用DNA切膠回收試劑盒進行切膠回收；

所述的適當比例為ybaC基因與pMD18-T載體物質的量比為10:1；

所述的陽性鑒定是通過對轉化后單菌落提質粒，通過電泳條帶進行鑒定；

(4)、表達載體pKK223-3-ybaC的構建：使用質粒小量提取試劑盒提取陽性質粒pMD18-T-ybaC，限制酶EcoRI和PstI雙酶切后電泳并切膠回收ybaC片段，采用適量配比與已被限制酶EcoRI和PstI雙酶切并純化的表達載體pKK223-3混合，最后使用T₄DNA連接酶過夜連接；連接后轉化大腸埃希氏菌JM110，并進行陽性鑒定，將陽性單菌落插入片段測序；

所述的表達載體pKK223-3的純化為使用DNA片段回收試劑盒進行純化回收；

所述的適量配比為ybaC基因與pKK223-3載體物質的量比為10:1；

所述的陽性鑒定是通過對轉化后單菌落提質粒并用限制酶EcoRI和PstI雙酶切，酶切產物通過電泳條帶進行鑒定；

最后獲得的表達載體已經成功轉入ybaC基因，命名為pKK223-3-ybaC；

最后獲得的菌株成功轉入ybaC基因，命名為大腸埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)。

7.一種利用權利要求1所述的可表達乙酰酯酶的大腸埃希氏菌液態發酵制備乙酰酯酶的方法，該方法是：

將大腸埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)接種于氨芐LB液體培養基中于37℃、150rpm全溫振蕩培養箱中活化培養3d，吸取200μL菌懸液接種于氨芐LB液體培養基中于37℃、180rpm全溫振蕩培養箱中進行發酵，37℃過夜培養后加入終濃度為0.6mmol/L的IPTG，共計發酵5d，將發酵產物1000g，4℃低溫離心8min，上清液即為乙酰酯酶粗酶液；所述的氨芐LB液體培養基構成如下：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，加水定容至1000mL，滅菌后加入終濃度為1.0mmol/L的氨芐青霉素。