[發明專利]一種利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法在審
| 申請號： | 201510077399.8 | 申請日： | 2015-02-13 |
| 公開（公告）號： | CN104726401A | 公開（公告）日： | 2015-06-24 |
| 發明（設計）人： | 榮耀星;時兆田;于艷秋;李秀文;鄧雯雯;張停停;呂亞楠 | 申請（專利權）人： | 中國醫科大學;沈陽澔源生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0775 | 分類號： | C12N5/0775 |
| 代理公司： | 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107 | 代理人： | 史力伏 |
| 地址： | 110122 遼*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 利用 胎盤 間充質 干細胞 提高 臍血間充質 培養 成功率 方法 | ||
1.一種利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，包括以下步驟：
步驟1、胎盤的采集及運輸；
步驟2、剔除胎盤的羊膜和蛻膜得到胎盤小葉；
步驟3、將胎盤小葉剪切至1mm3的組織塊，加入注射用水裂解紅細胞并清洗；
步驟4、使用Ⅰ型膠原酶消化得到細胞外基質蛋白和組織塊組成的糊狀混合物；
步驟5、取上述糊狀混合物涂抹在培養皿內晾干固定；
步驟6、向上述培養皿內加入無血清培養體系進行原代培養并全量換液；
步驟7、待胎盤間充質干細胞融合率達到標準時，使用細胞消化液消化收集原代細胞并進行傳代；
步驟8、對胎盤間充質干細胞進行細胞生物學鑒定；
步驟9、收集第三代胎盤間充質干細胞接種于Transwell共培養系統的下室；
步驟10、采集臍血后使用分離液對臍血單個核細胞進行提?。?/p>
步驟11、收集的臍血單個核細胞接種于Transwell的上室，添加無血清培養體系培養；除去懸浮細胞并進行首次全量換液，與下室的胎盤間充質干細胞在低氧環境下共培養，收集上室的原代細胞進行傳代擴增；
步驟12、對擴增的臍血間充質干細胞進行細胞生物學鑒定。
2.如權利要求1所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟3中注射用水裂解紅細胞的時間為1-5min。
3.如權利要求2所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟3中注射用水裂解紅細胞的時間為2min。
4.如權利要求1所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟4中Ⅰ型膠原酶短時消化時間為5-20min。
5.如權利要求4所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟4中Ⅰ型膠原酶短時消化時間為10min。
6.如權利要求1所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟6中無血清培養體系為無血清培養液，并添加5%的無血清添加劑、0.4mmol/L?α-酮戊二酸、20ng/mL的層粘連蛋白-5、0.05mg/L的谷胱甘肽。
7.如權利要求1所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟6中的胎盤間充質干細胞原代培養首次全量換液時間為培養24h。
8.如權利要求7所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟11中的臍血間充質干細胞原代培養首次全量換液時間為培養24h。
9.如權利要求8所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟11中的低氧條件為氧氣10%、二氧化碳5%、氮氣85%。
10.如權利要求9所述的利用胎盤間充質干細胞提高臍血間充質干細胞培養成功率的方法，其特征在于，所述步驟11中的收集上室的原代細胞進行擴增時的標準是融合率達到60%。
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