[發(fā)明專利]一種高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510077218.1
• 申請日: 2015-02-12
• 公開（公告）號: CN104694635B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設計）人: 鄭洪坤;劉慧
• 申請（專利權(quán)）人: 北京百邁客生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.一種高通量簡化基因組測序文庫的構(gòu)建方法，由以下步驟組成：

(1)用限制性內(nèi)切酶分別對不同樣品的基因組DNA進行酶切，獲得5’末端具有磷酸化修飾的平末端DNA片段；所述基因組DNA是經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計法檢測后再進行稀釋的；所述的基因組DNA濃度為20～100ng/μL；所述限制性內(nèi)切酶是一種或多種平末端限制性內(nèi)切酶；

(2)分別對不同樣品的5’磷酸化平末端DNA片段的3’末端添加堿基A，獲得具有粘性末端A的DNA片段；

(3)分別將不同樣品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段與含有可以區(qū)分樣品的唯一條形碼序列的接頭相連，獲得可以區(qū)分樣品來源的連接產(chǎn)物；

(4)含有不同條形碼的連接產(chǎn)物進行PCR擴增，獲得含有不同條形碼序列的擴增產(chǎn)物，純化，定量，根據(jù)實際需要將其混合；進行瓊脂糖凝膠分離純化，獲得特定長度的片段；

(5)對特定長度片段進行低循環(huán)PCR擴增，獲得接頭和接頭二聚體比例大幅減少的目的片段擴增產(chǎn)物；進行瓊脂糖凝膠分離純化，純化產(chǎn)物構(gòu)成高通量簡化基因組測序文庫。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)所述的基因組DNA濃度為20～100ng/μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶是一種或多種平末端限制性內(nèi)切酶，其酶切產(chǎn)生的限制性片段是具有5’末端磷酸化修飾的平末端DNA片段。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)接頭的序列含有8堿基條形碼序列的正鏈和8堿基條形碼序列的負鏈。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述接頭的序列為：

正鏈：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

負鏈：

P-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACYYYYYYYYATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；

其中：正鏈中的XXXXXXXX代表正鏈條形碼序列，負鏈中的YYYYYYYY代表負鏈條形碼序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，正鏈條形碼序列XXXXXXXX和負鏈條形碼序列YYYYYYYY選擇以下對應的任意一個條形碼：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)和步驟(5)中，PCR擴增所用的引物序列為：

引物序列P1：CAAGCAGAAGACGGCATACG

引物序列P2：AATGATACGGCGACCACCGA。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，純化后擴增產(chǎn)物的定量檢測方法可以是紫外分光光度計法、核酸熒光定量法、瓊脂糖凝膠電泳檢測。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，減少接頭和接頭二聚體比例的方法是磁珠法純化PCR擴增產(chǎn)物和對低循環(huán)PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠分離純化。

10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的低循環(huán)PCR擴增反應所用的循環(huán)數(shù)不超過8個。