[發明專利]一種鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法

有效

• 申請號: 201510076301.7
• 申請日: 2015-02-11
• 公開（公告）號: CN104694483B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 羅霞;付小哲;李寧求;黃志斌;林強
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明涉及鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法。

背景技術

鱖魚（Siniperca chuatsi）是我國重要的淡水特色養殖品種之一，而近年來由傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）引起的鱖虹彩病毒病給鱖魚養殖產業造成了嚴重的經濟損失。1997年，吳淑勤等首先在患病鱖魚中發現了直徑150nm的球形病毒，并認為是鱖魚暴發性傳染病的病原。1998年，何建國等通過回歸感染進一步證明了該病毒的病原性，通過組織學研究發現鱖魚脾臟和腎臟是其感染的主要器官，將其命名為傳染性脾腎壞死病毒，并通過主衣殼蛋白（MCP）基因等序列分析確定其為一種虹彩病毒。根據國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第八次報告，ISKNV是虹彩病毒科腫大細胞病毒屬的代表種，其傳染力強，發病率高達30％，致死率高達90％以上，可以感染近60種淡水和海水魚，給鱖魚、加洲鱸、烏鱧、美國紅魚、石斑魚等海淡水魚類養殖業造成了巨大威脅。自1994年以來，ISKNV給我國鱖魚養殖業造成的平均年經濟損失高達2億元，是制約鱖魚養殖業健康發展的主要瓶頸。

免疫接種是預防傳染病發生的主要手段，付小哲實驗室建立了ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB，研制出細胞培養滅活疫苗。但如何以低成本生產獲得高滴度病毒是疫苗制備的關鍵步驟。病毒接種方法有兩種，同步接毒和異步接毒。同步接毒法是在細胞傳代同時或不久接種毒種，進行培養，如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細小病毒)；異步接毒法是在細胞形成單層后接種毒種，如流行性乙型腦炎細胞培養疫苗。目前多數病毒采用異步接毒法這種接毒方式。

羅維等在適合豬圓環病毒2生長的PK15均質細胞株的構建中發現異步接毒樣品的 PCR 檢測結果均為陽性，且信號都較強，說明異步接毒比同步接毒要穩定，重復性較好，不會出現接不上毒的情況。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，包括以下步驟：

1)將ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB傳代后培養20～96小時，使用胰酶消化細胞；

2)將消化后的CPB細胞轉入含有5%v/v～10%v/v胎牛血清的L15培養液中，同時接種ISKNV；

3)28～32℃恒溫培養接種后的鱖腦組織細胞系CPB 2d～12d，收獲細胞并提取病毒核酸。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟1）中ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB傳代后培養時間為30h～60h。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟2）中培養液中胎牛血清的添加量為5%v/v～8%v/v。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟2）中按照MOI值為0.85～2.3接種ISKNV 。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟3）中恒溫培養，觀察CPE達80%以上時收獲細胞并提取病毒核酸。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟1）中ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB傳代后培養時間為20h～40h。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟2）中培養液中胎牛血清的添加量為8%～10%v/v。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟2）中按照MOI值為30～45接種ISKNV。

進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟3）中恒溫培養，觀察CPE達80%以上時收獲細胞并提取病毒核酸。

本發明的有益效果是：