[發明專利]一種羊骨髓間充質干細胞的分離與培養方法在審
| 申請號： | 201510074090.3 | 申請日： | 2015-02-11 |
| 公開（公告）號： | CN104630143A | 公開（公告）日： | 2015-05-20 |
| 發明（設計）人： | 陳海佳;王一飛;葛嘯虎;陳潔鴻;羅二梅 | 申請（專利權）人： | 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0775 | 分類號： | C12N5/0775 |
| 代理公司： | 廣州圣理華知識產權代理有限公司 44302 | 代理人： | 頓海舟;陳業勝 |
| 地址： | 510000 廣東省廣州市國*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 種羊 骨髓 間充質 干細胞 分離 培養 方法 | ||
1.一種羊骨髓間充質干細胞的分離與培養方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)獲取羊骨髓
(2)將離心管中的骨髓用PBS洗滌后，加入等體積的完全培養基重懸細胞，另取一離心管加入等體積的Ficoll分離液，將骨髓細胞懸液緩慢加入到Ficoll分離液上層，離心后吸取單個核細胞層，用PBS清洗，用完全培養基重懸細胞后，接種到完全培養基中貼壁培養；
(3)接種18～24h后，棄去未貼壁的細胞及培養基，用PBS清洗后，加入含5～10μg/L?EGF和50～100mg/L?NEAA的完全培養基繼續培養，即可得到羊骨髓間充質干細胞；
完全培養基為含有10％FBS的DMEM/F12培養基，百分數為體積百分數。
2.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，所述離心管是采用SepMateTM離心管，安裝有插件。
3.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，所述羊骨髓的獲取是通過選擇5個月大的健康羊，將其麻醉后用骨髓穿刺針沿髂骨緣刺入直至髓腔，接上預先置有100U肝素抗凝劑的注射器抽吸骨髓，再轉移到真空采血管中，置于冰盒中保存。
4.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，步驟(2)所述將離心管中的骨髓用PBS洗滌是用等體積的PBS洗滌。
5.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，步驟(2)所述貼壁培養和步驟(3)所述培養是放置于5％CO2、37℃的培養箱中培養。
6.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，步驟(2)所述離心是在700g離心20min。
7.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，步驟(3)所述用PBS清洗是用PBS清洗2遍。
8.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，步驟(3)所述含5～10μg/L?EGF和50～100mg/L?NEAA的培養基要求每3天更換一次。
9.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，所述NEAA為Invitrogen公司產品，產品目錄號為11140。
10.根據權利要求1所述的分離與培養方法，其特征在于，步驟(2)所述接種的接種密度是1×106/mL。
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