[發明專利]利用灰平鏈霉菌StreptomycesgriseoplanusS501固態發酵生產外切菊粉酶的方法

有效

• 申請號: 201510074039.2
• 申請日: 2015-02-11
• 公開（公告）號: CN104611311B
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發明（設計）人: 于基成;陳嬌;劉秋;于東寧
• 申請（專利權）人: 大連民族學院
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12R1/465
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙)21235
• 代理人: 胡景波

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種利用灰平鏈霉菌Streptomyces griseoplanus S501固態發酵生產外切菊粉酶的方法。

背景技術

菊粉是一種天然的果聚糖，由D-呋喃果糖以β-2,1糖苷鍵相連，其還原端連接一個葡萄糖基，呈直鏈結構。富含菊粉的植物主要有菊芋、菊苣等，菊粉以其具有的益生元等獨特功能而近年來備受食品行業的關注，應用前景十分廣闊。菊粉酶是能夠水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，按作用的方式主要分為內切酶和外切酶。外切型菊粉酶水解菊粉可生產高純度果糖，內切型菊粉酶則可水解菊粉生產低聚果糖，這兩種物質均可分別作為食品添加劑，也可進一步發酵生產酒精、有機酸等產品^[1]。菊粉酶的來源廣泛，自然界中的許多微生物都可以產生菊粉酶^[2-^3]。

目前，菊粉酶傳統的生產方法一般采用微生物液態發酵。近年來，多有文獻報道采用固態發酵法生產菊粉酶^[4-7]。在酶生產方面，固態發酵相比于液態發酵有很多的優勢，如產酶活性高、技術簡單、成本低、能耗低、產廢水少以及更高的產品回收率等。因此，固態發酵更適合工業化生產，而且通過固態發酵制得的粗酶可以直接用于生物合成和生物轉換酶的來源。但是大多數的研究均以含菊粉植物菊芋、菊苣等作為碳源對菌株進行產菊粉酶的誘導，導致使用菊粉生產酶的成本較高，不適合工業生產，如果可以尋找一種價廉易得的碳源來得到酶活高的菊粉酶，則可以滿足工業生產的需求。

食品加工廠在生產過程中會產生大量的大蒜皮，這些大蒜皮在日常中使用率極低，通常作為垃圾處理，全國每年廢棄處理的大蒜皮達到20萬噸，造成了大量的浪費，同時也對環境造成了污染。

發明人自行申請的申請號為201310691141.8；申請日為：2013 年12月13日；申請人為：大連民族學院；發明名稱為：一株產內切菊粉酶的灰平鏈霉菌S501及其培養方法和應用的發明專利，涉及一株從自然界中分離出的微生物灰平鏈霉菌Streptomyces griseoplanus S501，所述的灰平鏈霉菌Streptomyces griseoplanus S501，已于2013年9月13日提交保藏。

在上述專利申請中提及利用該微生物采用液態發酵法產內切菊粉酶，其產酶活力可達121.62U/ml。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用灰平鏈霉菌Streptomyces griseoplanus(以下稱S.griseoplanus)S501固態發酵生產外切菊粉酶的方法。

本發明是發明人在自行申請的申請號為201310691141.8的發明專利的基礎上進一步研究。發明人在實踐中發現，液態發酵方法耗時、耗力，而且由于采用菊粉作為碳源，成本高，不適合工業化生產，故而發明人試圖改用固態發酵的方法生產內切菊粉酶，但是實驗中意外的發現采用發明人實驗中的一種方法最終產物不是內切菊粉酶，而是外切菊粉酶，而且外切菊粉酶酶活大幅度提高，達到了出乎預料的技術效果，具有顯著的進步。外切菊粉酶水解產物為高純度果糖，是比蔗糖更為優秀的甜味劑、功能性食品原料和添加劑，而傳統方法生產的外切菊粉酶，酶活低、成本高，且工藝方法復雜，本發明恰恰克服了上述缺陷，提供了一種工藝簡單、酶活高、成本低的生產外切菊粉酶的方法。

本發明的技術方案如下：利用灰平鏈霉菌Streptomyces griseoplanus S501固態發酵生產外切菊粉酶的方法，該固態發酵方法包括以下步驟：將菌株S501凍干粉以無菌水配成菌懸液，用無菌簽子蘸取適量于選擇培養基上，在28℃下培養3-5d，將孢子刮下，置于無菌水中稀釋至孢子菌懸液濃度為10⁶cfu/mL，孢子菌懸液按8.0～12.0％(v/w)的接種量接入固態發酵培養基中，所述的接種量是指 孢子菌懸液體積(ml)與固態發酵培養基的質量(g)的比例；于28℃靜止培養3-6d；待發酵結束后，以干重計，每克固態發酵培養基基質加入5mL去離子水，振蕩提取1h，用紗布過濾，將濾液于4℃，轉速8000rpm/min離心20min得到含外切菊粉酶的上清液，將上清液按常規冷凍干燥法制得外切菊粉酶；