[發明專利]用于區分棉鈴蟲和煙青蟲的特異性引物與方法

有效

• 申請號: 201510073931.9
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104651507A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 崔金杰;李兆群;張帥;雒珺瑜;呂麗敏;王春義;李春花;朱香鎮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.用于區分棉鈴蟲和煙青蟲的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物如下所示：

Primer-F：5’-AACACCAATTAAAACTCCCACAATT-3’；

Primer-R：5’-TGTGAGCCAGGTTGGTTTCTAT-3’。

2.區分棉鈴蟲和煙青蟲的方法，其特征在于，所述方法以待測樣本的基因組DNA為模板，利用權利要求1所述特異性引物進行PCR擴增，對擴增產物進行測序，根據產物核苷酸序列的155bp-158bp位置是否存在TTAT堿基序列，判斷樣本為棉鈴蟲或煙青蟲。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體系為：

無菌水28.75μL10×PCR反應緩沖液5μL25mmol/L氯化鎂5μL2.5mmol/L?dNTP4μL10μmol/L?Primer-F2.5μL10μmol/L?Primer-R2.5μL5u/μL?Taq酶0.25μL25mg/L?DNA模板2.0μL總體積50μL。

4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述PCR反應程序為：95℃預變性3min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環35次；72℃延伸7min。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：

1)合成特異性引物；

2)采用動物組織細胞提取待測樣本的基因組DNA；

3)在PCR反應管中加入反應體系，混勻；

4)將PCR管放入臺式離心機中離心10s后插入PCR儀中；

5)運行PCR反應；

6)反應結束后取出PCR反應管，對PCR反應產物進行電泳檢測；

7)以無菌水作為空白對照PCR反應體系的模板；

8)將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳；

9)電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，置于膠成像儀上成像。根據DNA分子量標準估計擴增條帶的大小；

10)PCR產物測序；

11)根據產物核苷酸序列的155bp-158bp位置是否存在TTAT堿基序列，判斷樣本為棉鈴蟲或煙青蟲。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟8)具體為按15g/L的濃度稱取瓊脂糖，加入1×TAE緩沖液中，加熱溶解，配制成瓊脂糖溶液；按每100mL瓊脂糖溶液中加入5μL?EB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，溫室下凝固成凝膠后，放入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板；取5μL?PCR產物與3μL加樣緩沖液混合后加入點樣空中，同時在其中一個點樣孔中加入DNA分子標準，接通電源在2V/cm～5V/cm條件下電泳。

7.含有權利要求1所述特異性引物的試劑盒。