[發(fā)明專利]Platyamoeba thermophila生產(chǎn)耐熱超氧化物歧化酶（SOD）的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510073464.X
• 申請(qǐng)日: 2015-02-11
• 公開（公告）號(hào): CN104694512A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁彥蕊;王雪芹;饒榕;牟兆琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02
• 代理公司: 無(wú)
• 代理人: 無(wú)

技術(shù)領(lǐng)域

利用Platyamoeba?thermophila生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及利用菌株P(guān)latyamoeba?thermophila保藏號(hào)為ATCC?50600，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵獲得耐高溫SOD。

背景技術(shù)

超氧化物歧化酶(superoxide?dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷的能力。近年來(lái)，它已經(jīng)成為治療炎癥、腫瘤和自身免疫疾病的新型抗炎藥物；化妝品和食品行業(yè)中用于防曬、防皮膚衰老和抗炎的添加劑以及用于某些疾病探針的生化試劑。SOD廣泛存在于動(dòng)物、植物、所有好氧微生物及少數(shù)厭氧微生物體內(nèi)。當(dāng)前，SOD主要從動(dòng)物血液(如豬血或者牛血)中提取(袁燁.超氧化物歧化酶的制備方法[P].申請(qǐng)?zhí)?02147888.0,2002-12-19；徐文中,閻家麒.超氧化物歧化酶大規(guī)模生產(chǎn)新工藝[P].申請(qǐng)?zhí)?01144922.5,2001-12-24)，產(chǎn)量受到很大限制，且容易受到原料來(lái)源、安全性及質(zhì)量不穩(wěn)定等因素的影響。由于動(dòng)物、植物特別是動(dòng)物血液來(lái)源困難，而微生物可以人工培養(yǎng)，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)目前報(bào)道，已經(jīng)可以通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)SOD，但主要為胞內(nèi)酶(刁治民,姚銀霞，張文靜.酵母菌SOD發(fā)酵條件的研究[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002,4:48-51；楊明琰,郭愛(ài)蓮,沈儉,等.高產(chǎn)SOD酵母菌的誘變選育及發(fā)酵條件研究[J].食品科學(xué),2005,26(10):147-150)，提取工藝較為繁瑣。

天然SOD熱穩(wěn)定性較差，在加工和使用過(guò)程中容易受熱失活。如何有效地解決SOD在高溫工藝條件下酶活力的穩(wěn)定問(wèn)題，如何使含SOD的產(chǎn)品在生產(chǎn)工藝流程中不用顧忌高溫是高效利用SOD的關(guān)鍵。利用生物工程生產(chǎn)新一代高穩(wěn)定性、高耐熱性的SOD是當(dāng)前SOD開發(fā)最重要的途徑。

本發(fā)明采用Platyamoeba?thermophila生產(chǎn)SOD，Platyamoeba?thermophila是一種耐熱菌,可以產(chǎn)生耐高溫的SOD,采用該菌發(fā)酵生產(chǎn)SOD具有發(fā)酵周期短，發(fā)酵液中SOD活力較高，且能耐高溫，開發(fā)前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容

目前能夠產(chǎn)生SOD的菌株比較少，主要為一些酵母，且為胞內(nèi)酶，需要破壁后才能提取分離，操作成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)制備。本發(fā)明的目的是針對(duì)當(dāng)前問(wèn)題，利用菌株P(guān)latyamoeba?thermophila保藏號(hào)為ATCC?50600，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵獲得胞外耐熱SOD。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成是碳源0.5-100g/l，氮源0.5-100g/l，K₂HPO₄1-4g/l,MgSO₄7H₂00.1-0.5g/l，NaCl?1-2g/l。在一定體積的發(fā)酵罐內(nèi)裝入發(fā)酵體積60-70％(v/v)的培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入Platyamoeba?thermophila，接種量為1-10％，起始pH和發(fā)酵過(guò)程pH均為自然，發(fā)酵溫度為20-60℃，發(fā)酵周期為2-6天。最終發(fā)酵液中SOD活力最高可達(dá)3000U/ml。

本發(fā)明所有種子培養(yǎng)基配方與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。將斜面菌種接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶后，種子的培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，種子的培養(yǎng)溫度為45℃。

菌種保存用斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/l，MgSO₄7H₂00.2g/l，酵母膏g/l，瓊脂20g/l，pH自然。

SOD活的測(cè)定方法是基于SOD抑制氮藍(lán)四唑(NBT)在光下的還原作用。SOD活力測(cè)定方法和SOD活力定義詳見：Chin-Wen?Lin,Jeng-Huh?Yang?and?Lieh-Chi?Su，The?extraction?and?properties?of?superoxide?dismutase?from?porcine?blood?Chin-Wen?Lin,Jeng-Huh?Yang?and?Lieh-Chi?Su，Meat?Science，1997，46(3):303-312.

本發(fā)明有如下特征：