[發(fā)明專利]一種鮭腎桿菌的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510072648.4
• 申請(qǐng)日: 2015-02-11
• 公開（公告）號(hào): CN104611447A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐立蒲;王靜波;王小亮;曹歡;張文;王姝;潘勇;江育林;那立海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 欒波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種鮭腎桿菌的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

鮭腎桿菌(Renibacterium?salmoninarum)是腎桿菌屬的唯一成員，是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌。其具有以下形態(tài)：規(guī)則短桿菌，0.3～1.0μm×1.0～1.5μm。成對(duì)，有時(shí)成短鏈。細(xì)胞呈革蘭氏陽(yáng)性，沒有莢膜，不運(yùn)動(dòng)，不生孢，好氧。

鮭腎桿菌廣泛分布在大量養(yǎng)殖鮭科魚類及出產(chǎn)鮭科魚類的國(guó)家和地區(qū)，如加拿大、智利、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、冰島、意大利、日本、西班牙、美國(guó)和南斯拉夫等。在魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，為了了解養(yǎng)殖魚的生長(zhǎng)狀態(tài)，常需要對(duì)其進(jìn)行不定期的定性檢測(cè)。

在相關(guān)技術(shù)中，該菌常見的檢測(cè)方法為將供試樣品在增菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間，然后通過觀察菌落形態(tài)、生化鑒定以判定供試樣品中是否含有該菌。

然而由于鮭腎桿菌的生長(zhǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)速度緩慢，而且后續(xù)分離培養(yǎng)的技術(shù)難度很大，進(jìn)而造成這種常規(guī)方法的檢測(cè)結(jié)果不可信，存在準(zhǔn)確度低的缺陷。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鮭腎桿菌的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種鮭腎桿菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)、取待檢樣品，并進(jìn)行預(yù)處理；

2)、對(duì)預(yù)處理后的樣品進(jìn)行細(xì)菌核酸提取，以提取到的核酸為模板，以P3和M21為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3)、以步驟2)得到的擴(kuò)增片段為模板，以P4和M38為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

4)、將步驟2)和步驟3)得到的擴(kuò)增片段分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、回收以及測(cè)序后分別與如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析；

其中，P3、M21、P4和M38的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6所示。

本發(fā)明提供的這種鮭腎桿菌的檢測(cè)方法，其實(shí)現(xiàn)了鮭腎桿菌的分子檢測(cè)，具體的，以特定的引物P3和M21對(duì)從待檢樣品中提取的核酸進(jìn)行初步擴(kuò)增；若待檢樣品中含有鮭腎桿菌，則經(jīng)過PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物中含有鮭腎桿菌P57表面蛋白基因DNA片段(可經(jīng)過電泳初步檢測(cè))。

為了防止單一的PCR擴(kuò)增易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，對(duì)第一次擴(kuò)增后的片段以P4和M38為引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并將得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳(若出現(xiàn)相應(yīng)的特異性條帶，則說明該樣品中含有鮭腎桿菌)。進(jìn)一步的，為了確保使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；分別對(duì)兩次PCR擴(kuò)增后的片段電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序；并將其分別與鮭腎桿菌P57表面蛋白基因383bp的DNA片段序列(SEQ?ID?NO：1)、鮭腎桿菌P57表面蛋白基因320bp的DNA片段序列(SEQ?ID?NO：2)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，通過判定待檢樣品中是否含有鮭腎桿菌P57表面蛋白基因，并結(jié)合兩次PCR的電泳結(jié)果可準(zhǔn)確的獲知該待檢樣品中是否含有鮭腎桿菌。

可選的，在步驟1)中：

所述預(yù)處理包括將待檢樣品研磨后并加入血清體積百分含量為8-12％的199細(xì)胞培養(yǎng)液。

可選的，在步驟1)中：

所述待檢樣品取自待檢個(gè)體的肝或腎。

可選的，在步驟2)中：

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：模板8-12μl，10Mm的dNTP1-3μl、100pmol/μl的P32-3μl，100pmol/μl的M212-3μl，25mM的MgCl₂9-11μl，10×PCR?buffer?8-12μl，5U/μl的Taq酶1μl，DEPC水補(bǔ)齊至100μl。

可選的，在步驟2)中：

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4-5min；94℃變性28-32s，60℃退火28-32s，72℃延伸60-70s，共30-35個(gè)循環(huán)：

可選的，在步驟3)中：

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：模板4-6μl，10Mm的dNTP1-3μl、100pmol/μl的P42-3μl，100pmol/μl的M382-3μl，25mM的MgCl₂9-11μl，10×PCR?buffer?8-12μl，5U/μl的Taq酶1μl，DEPC水補(bǔ)齊至100μl。

可選的，在步驟3)中：