[發明專利]白色高溫雙歧菌生產耐熱超氧化物歧化酶（SOD）的方法

在審

• 申請號: 201510070687.0
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104694503A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 丁彥蕊;牟兆琳;王雪芹;饒榕
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/01
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

利用白色高溫雙歧菌生產超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程技術領域。本發明涉及利用菌株Thermobifida?alba保藏號為ATCC?27644，通過液態發酵獲得耐高溫SOD。

背景技術

超氧化物歧化酶(superoxide?dismutase，簡稱SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能夠增強機體抗輻射損傷的能力。近年來，它已經成為治療炎癥、腫瘤和自身免疫疾病的新型抗炎藥物；化妝品和食品行業中用于防曬、防皮膚衰老和抗炎的添加劑以及用于某些疾病探針的生化試劑。SOD廣泛存在于動物、植物、所有好氧微生物及少數厭氧微生物體內。當前，SOD主要從動物血液(如豬血或者牛血)中提取(袁燁.超氧化物歧化酶的制備方法[P].申請號,02147888.0,2002-12-19；徐文中,閻家麒.超氧化物歧化酶大規模生產新工藝[P].申請號,01144922.5,2001-12-24)，產量受到很大限制，且容易受到原料來源、安全性及質量不穩定等因素的影響。由于動物、植物特別是動物血液來源困難，而微生物可以人工培養，有利于實現工業化生產。根據目前報道，已經可以通過微生物發酵法生產SOD，但主要為胞內酶(刁治民,姚銀霞，張文靜.酵母菌SOD發酵條件的研究[J].青海師范大學學報(自然科學版)，2002,4:48-51；楊明琰,郭愛蓮,沈儉,等.高產SOD酵母菌的誘變選育及發酵條件研究[J].食品科學,2005,26(10):147-150)，提取工藝較為繁瑣。

天然SOD熱穩定性較差，在加工和使用過程中容易受熱失活。如何有效地解決SOD在高溫工藝條件下酶活力的穩定問題，如何使含SOD的產品在生產工藝流程中不用顧忌高溫是高效利用SOD的關鍵。利用生物工程生產新一代高穩定性、高耐熱性的SOD是當前SOD開發最重要的途徑。

本發明采用白色高溫雙歧菌生產SOD，白色高溫雙歧菌是一種耐熱菌,可以產生耐高溫的SOD,采用該菌發酵生產SOD具有發酵周期短，發酵液中SOD活力較高，且能耐高溫，開發前景廣闊。

發明內容

目前能夠產生SOD的菌株比較少，主要為一些酵母，且為胞內酶，需要破壁后才能提取分離，操作成本高，不利于大規模生產制備。本發明的目的是針對當前問題，利用菌株Thermobifida?alba保藏號為ATCC?27644，通過液態發酵獲得胞外耐熱SOD。

本發明的技術方案如下：液態發酵培養基組成是碳源0.5-100g/l，氮源0.5-100g/l，K₂HPO₄1-4g/l,MgSO₄7H₂00.1-0.5g/l，NaCl?1-2g/l。在一定體積的發酵罐內裝入發酵體積60-70％(v/v)的培養基，滅菌冷卻后接入白色高溫雙歧菌，接種量為1-10％，起始pH和發酵過程pH均為自然，發酵溫度為20-45℃，發酵周期為2-6天。最終發酵液中SOD活力最高可達1300U/ml。

本發明所有種子培養基配方與發酵培養基相同。將斜面菌種接種到裝有種子培養基的三角瓶后，種子的培養時間為48小時，種子的培養溫度為45℃。

菌種保存用斜面培養基配方為：葡萄糖20g/l，MgSO₄7H₂00.2g/l，酵母膏g/l，瓊脂20g/l，pH自然。

SOD活的測定方法是基于SOD抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用。SOD活力測定方法和SOD活力定義詳見：Chin-Wen?Lin,Jeng-Huh?Yang?and??Lieh-Chi?Su，The?extraction?and?properties?of?superoxide?dismutase?from?porcine?blood?Chin-Wen?Lin,Jeng-Huh?Yang?and?Lieh-Chi?Su，Meat?Science，1997，46(3):303-312.

本發明有如下特征：

(1)白色高溫雙歧菌用于SOD發酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃、NaNO₃、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米漿、黃豆餅粉。