[發明專利]一種定量測定五羥色胺的方法

有效

• 申請號: 201510069784.8
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104698058B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發明（設計）人: 程寒;楊沫;馬婷婷;王慧霞
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48;G01N27/30
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司11228
• 代理人: 張瑾

技術領域

本發明涉及分析化學、電分析化學、生物電分析化學技術領域，具體涉及一種定量測定神經遞質五羥色胺的電化學檢測方法。

背景技術

五羥色胺(5-HT)是大腦內主要神經遞質之一，在腦神經細胞內合成，可參與多種生理功能及病理狀態的調節，如體溫，睡眠、飲食、精神情感性疾病等。五羥色胺是一種電活性物質，可以采用電化學方法進行檢測，但其氧化過程中產生的氧化活性產物易吸附在各種不同材料的電極表面形成絕緣膜，包括貴金屬電極，玻碳電極、碳纖維電極以及鵬摻雜金剛石電極等，導致電極表面被污染而影響檢測靈敏度與穩定性。

碳纖維超微電極具有高時間、空間分辨率及高靈敏度等優良特性，近年來在多個領域得到了廣泛而深入的研究，已成為電化學研究中極具發展前景的一個重要分支。由于它能夠在生物體系中檢測特定微區內的快速而微小的化學變化，超微電極電化學檢測被廣泛應用在生物微環境中探索細胞化學，而且特別適宜于活體分析。然而，在生物電化學分析體系中，碳纖維超微電極表面易被電化學反應中產生的自由基或電聚合產物污染而鈍化，電極污染物主要是一些有機生物分子如五羥色胺，組胺，氨基酸，NADH，苯胺等以及其氧化、代謝產物，它們易在電極表面吸附形成絕緣膜，導致電極電信號隨時間延長急劇衰減。目前，碳纖維超微電極抗污染的方法主要通過快速循環伏安法以及對電極進行修飾處理。Jackson等報道了通過快速循環伏安法測定五羥色胺(Fast-Scan cyclic voltammetry of5-Hydroxytryptamine，Anal Chem，vol.67：1115-1120，1995)，該法能在一定程度上減輕電極污染，污染問題仍不能忽略，且同時會降低檢測靈敏度和選擇性。程寒等研制了單壁碳納米管修飾的碳纖維微電極(單壁碳納米管修飾電極的抗污染性能研究及其用于五羥色胺檢測，分析化學，vol.41：540-545，2013)，采用安培法對五羥色胺進行檢測，修飾電極對五羥色胺造成的電極污染有顯著的減輕。Hashemi等采用電鍍方法將陽離子交換聚合物Nafion修飾于碳纖維微電極表面(Voltammetric detection of 5-hydroxytryptamine release in the rat brain，Anal Chem，vol.81：9462-9471，2009)，用于老鼠大腦五羥色胺釋放動力學監測；朱明芳等制備了石墨烯-四磺酸基酞菁鐵修飾的碳纖維微電極(神經遞質分子電化學測定的新方法研究，華南理工大學博士學位論文，43-56，2012)，并用于小鼠海馬區中多巴胺和五羥色胺的同時測定，然而對電極進行修飾處理過程較復雜，還會污染環境，且修飾電極往往存在修飾物在電極表面附著不夠牢固、膜的厚度難以控制、電極壽命較短等缺點。

發明內容

針對現有技術中五羥色胺測定方法的上述不足，本發明提供了一種新的定量檢測五羥色胺的方法。

本發明提供的定量測定五羥色胺的方法，過程包括：

(1)碳纖維超微電極經清洗后用循環伏安法活化，再用超純水清洗，得到活化后潔凈的碳纖維超微電極，記為潔凈電極；

(2)采用雙電極系統，所有電位均以Ag/AgCl作為參比電極，潔凈電極和經火焰灼燒活化的該潔凈電極為工作電極，鐵氰化鉀水溶液或多巴胺水溶液為基準溶液，梯度濃度的五羥色胺溶液作為標準溶液，采用差分脈沖伏安法進行檢測；

A、首先取一根潔凈電極在基準溶液中掃描，記錄峰電流作為基準電流；潔凈電極用超純水清洗晾干，再在任一濃度五羥色胺標準樣品中掃描，記錄氧化峰電流；

B、測試完該濃度五羥色胺的潔凈電極用超純水清洗晾干，火焰灼燒進行活化后再在基準溶液中掃描，記錄峰電流，然后將電極清洗晾干，在另一濃度五羥色胺標準樣品中掃描，記錄氧化峰電流；

重復B步驟至完成全部五羥色胺標準樣品的測試；

(3)以各次經火焰灼燒活化后的潔凈電極在基準溶液中的峰電流與基準電流的比值為電流校正因子，各梯度濃度五羥色胺溶液中氧化峰電流除以該濃度五羥色胺檢測時對應的校正因子為校正后五羥色胺溶液中氧化峰電流；

以五羥色胺濃度和校正后五羥色胺溶液中氧化峰電流繪制成標準曲線，進而得到相應的線性回歸方程；

(4)取待測樣品去除其中的細胞和蛋白后，步驟(2)的電極用超純水清洗晾干，火焰灼燒進行活化后在基準溶液中掃描，記錄峰電流，然后將電極清洗晾干，在待測樣品中掃描，記錄氧化峰電流；將峰電流值帶入線性回歸方程中，得到待測樣品中五羥色胺的濃度。