[發(fā)明專利]紅頸常室繭蜂特異性COI引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510065234.9
• 申請日: 2015-02-06
• 公開（公告）號: CN104630367A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李金花;楊帆;羅素萍;袁海濱;陸宴輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及紅頸常室繭蜂特異性COI引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

綠盲蝽Apolygus?lucorum(Meyer-Dür)屬于同翅目盲蝽科，是我國各棉區(qū)的盲蝽優(yōu)勢種，現(xiàn)已上升為棉田主要害蟲。對于綠盲蝽的防治，長期以來都未有十分有效的措施，一般是以化學(xué)農(nóng)藥防治為主。然而，隨著農(nóng)藥的的使用，綠盲蝽抗藥性不斷增強(qiáng)，綠盲蝽的防治難度加大。寄生性天敵作為生物防治的手段之一，依靠寄生因子如毒液、多分DNA病毒、類病毒顆粒、類病毒纖絲、卵巢蛋白、畸形細(xì)胞極其分泌蛋白等方式影響寄主的生殖發(fā)育最終導(dǎo)致其死亡，在害蟲控制方面發(fā)揮著積極重要的作用。

由于寄生蜂種類繁多復(fù)雜，且一般個(gè)體較小，從形態(tài)上較難鑒定區(qū)別。若想鑒定寄主體內(nèi)未成熟發(fā)育階段的寄生蜂，難度將更大。利用分子檢測手段，不論是對寄生蜂個(gè)體，還是對寄生于寄主體內(nèi)的寄生蜂，均可通過特異性引物擴(kuò)增完成鑒定，這就大大的減輕了鑒定工作的強(qiáng)度和難度，節(jié)省時(shí)間，準(zhǔn)確性高。

紅頸常室繭蜂(Peristenus?spretus?Chen&van?Achterberg)屬膜翅目繭蜂科，是綠盲蝽若蟲寄生蜂。由于寄生蜂在田間不易觀察，且被寄生的綠盲蝽易在田間死亡等原因，一直無法對其與綠盲蝽的寄生關(guān)系進(jìn)行更好的研究，鑒定工作也受到制約，無法準(zhǔn)確評估紅頸常室繭蜂對綠盲蝽的控制作用。本發(fā)明即提供了一種高效便捷的分子檢測方法，利用特異性引物擴(kuò)增有效鑒定紅頸常室繭蜂，為準(zhǔn)確評估紅頸常室繭蜂對綠盲蝽生物防治效果提供有效手段支撐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供紅頸常室繭蜂特異性COI引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)紅頸常室繭蜂的線粒體DNA序列，設(shè)計(jì)篩選得到一對紅頸常室繭蜂特異性COI引物，其包括：

正向引物PsF1：5’-TATTAAGAAGAATAATTGGGATG-3’

反向引物PsR1：5’-ATTTAAATTTCGATCTGTTAATAAC-3’。

本發(fā)明還提供含有引物PsF1和PsR1的用于檢測紅頸常室繭蜂的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq?DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液等中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

本發(fā)明還提供所述引物PsF1和PsR1，以及含有引物PsF1和PsR1的試劑盒在檢測紅頸常室繭蜂中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種紅頸常室繭蜂的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)提取樣品DNA；

2)以步驟1)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物PsF1和PsR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

3)分析PCR產(chǎn)物。

PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)大小為263bp的DNA擴(kuò)增條帶(SEQ?ID?No.3)，則判定樣品為紅頸常室繭蜂。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明設(shè)計(jì)一對特異性COI引物，該引物具有物種特異性，僅對紅頸常室繭蜂具有擴(kuò)增效果，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為263bp，靈敏度DNA濃度檢出限為0.625ng/μL，而對其它物種包括其近源種、盲蝽屬的其它盲蝽以及其他昆蟲無擴(kuò)增能力。

本發(fā)明在紅頸常室繭蜂檢測方面具有很高的價(jià)值，尤其當(dāng)需要檢測大量的樣品量時(shí)，本發(fā)明不僅節(jié)省時(shí)間而且準(zhǔn)確性高，在實(shí)際應(yīng)用中具有重要的意義。本發(fā)明利用PCR檢測技術(shù)，由特異性引物擴(kuò)增得到特異性單一條帶，操作簡單，具有高效、價(jià)廉、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，提高了檢測的準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中紅頸常室繭蜂特異性引物PsF1和PsR1在各昆蟲物種中的檢測結(jié)果；其中“M”代表DNA?Marker，“—”代表陰性對照。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中紅頸常室繭蜂特異性引物PsF1和PsR1的DNA濃度梯度檢測結(jié)果；其中，M：DNA?Marker；1-14為模板DNA濃度依次2倍稀釋濃度梯度；“—”為陰性對照。

具體實(shí)施方式