[發(fā)明專利]人源抗炭疽保護(hù)性抗原PA的抗體IgG及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510063977.2
• 申請(qǐng)日: 2015-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN104628853B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱進(jìn);熊四平;馮振卿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C07K16/12
• 分類號(hào): C07K16/12;C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10;A61K39/395;A61P31/04
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙)11470
• 代理人: 強(qiáng)紅剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于單克隆抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗炭疽保護(hù)性抗原的全分子人源單克隆抗體及其被編碼的DNA分子、包含該DNA分子的表達(dá)載體、含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及該全分子人源單克隆抗體在制備炭疽治療或預(yù)防性藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

炭疽病是一種由炭疽芽孢桿菌引起的人畜共患的急性烈性傳染病，牛、羊等食草動(dòng)物的發(fā)病率最高，人可通過接觸患炭疽的動(dòng)物及其畜產(chǎn)品或通過存在于空氣、土壤中的炭疽桿菌芽胞而被感染。炭疽桿菌具有高度致病性、其芽胞在惡劣環(huán)境中有較強(qiáng)的生存能力.可通過氣溶膠途徑感染，在世界范圍內(nèi)廣泛分布等特點(diǎn)，臨床上依據(jù)感染途徑不同將炭疽分為3型，即皮膚炭疽、吸入性炭疽和消化道炭疽。吸入性炭疽，叉稱肺炭疽，其致死率接近100％。炭疽芽孢桿菌在血液中可產(chǎn)生并釋放三種蛋白：保護(hù)性抗原(protective antigen，PA)、致死因子(lethal factor，LF)、水腫因子(edema factor，EF)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，炭疽毒素是一種AB(active-binding)的模式。PA是復(fù)合物中的“B”，與細(xì)胞膜上的炭疽毒素受體(2型毛細(xì)血管形成蛋白CMG2或腫瘤肉皮細(xì)胞標(biāo)志8TEM8)結(jié)合，由位于細(xì)胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD片段(PA63)發(fā)生寡聚化，在膜上形成七聚體((PA63)₇)。LF和EF是“A”，能夠結(jié)合七聚體形成的復(fù)合物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)吞小體酸性pH的環(huán)境下，PA七聚體發(fā)生構(gòu)象改變，形成一個(gè)管道，使EF和LF進(jìn)入細(xì)胞液，分別發(fā)揮毒性作用。這三種蛋白本身是無(wú)毒的，但PA和LF的混合物稱為致死毒素，PA和EF的混合物稱為水腫毒素。在體外實(shí)驗(yàn)研究中，單純使用高純度的致死毒素或水腫毒素可以使動(dòng)物死亡。通過阻斷PA與受體結(jié)合或是與LF及EF，以及影響其寡聚化，都可以有效防止炭疽毒素的致病作用。而且PA能誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫，是目前唯一獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的人用炭疽吸附疫苗(anthrax vaccine absorbed，AVA)的主要活性成分。因此，保護(hù)性抗原PA是炭疽病治療的理想靶點(diǎn)。

炭疽的醫(yī)學(xué)防護(hù)措施主要有預(yù)防和治療二大方面。目前，有效的預(yù)防措施主要是接種炭疽疫苗，接觸前1-2個(gè)月進(jìn)行預(yù)防接種，能為人群提供免疫防護(hù)。有效的治療措施主要有二大類：一類是根據(jù)炭疽病理模型設(shè)計(jì)的毒素抑制劑，主要包括炭疽毒素的中和抗體、可溶性受體、毒素突變體和小分子拮抗劑；另一類是炭疽桿菌的抑菌劑和殺菌劑，其中包括抗菌素和噬菌體的溶菌成分。抗菌素治療主要指炭疽感染時(shí)高劑量靜脈注射和口服抗生素以對(duì)炭疽桿菌產(chǎn)生殺傷作用，例如青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)霉素、紅霉素、和萬(wàn)古霉素等，但對(duì)于已釋放的毒素是沒有效果的，而且目前已發(fā)現(xiàn)具抗藥性的菌株。

國(guó)內(nèi)外的研究表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗體，能夠起到預(yù)防炭疽感染保護(hù)機(jī)體的作用。而且，在孢子攻毒后一定時(shí)間給藥(24-48h)仍能起到保護(hù)作用，即使是在出現(xiàn)體征后給藥也可以起到一定的治療作用。因此，進(jìn)行人源炭疽抗體的研究顯得尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抗炭疽保護(hù)性抗原的全分子人源單克隆抗體及其被編碼的DNA分子、包含該DNA分子的表達(dá)載體、含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及該全分子人源單克隆抗體在制備炭疽治療或預(yù)防性藥物中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究和不懈探索，最終采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選到了對(duì)炭疽保護(hù)性抗原PA具有高度親和力的人源Fab抗體，并獲取了賦予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，并將所述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)與含有抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體連接，最終獲得了具有特異的抗原結(jié)合性、優(yōu)異的毒素中和活性以及良好的動(dòng)物保護(hù)功能的全分子人源抗體。

具體地，本發(fā)明第一方面提供了如下全分子人源單克隆抗體的技術(shù)方案：

一種抗炭疽保護(hù)性抗原的全分子人源單克隆抗體，包含重鏈可變區(qū)、恒定區(qū)，和輕鏈可變區(qū)、恒定區(qū)，其中：

(1)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；

且(2)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。