[發(fā)明專利]煙草根黑腐病菌的分子檢測引物及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510062876.3
• 申請日: 2015-02-06
• 公開（公告）號: CN104726556A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邢國珍;封松利;鄭文明;申一林;宋鵬宇;王海濤;蔣士君;李淑君
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
• 代理公司: 河南科技通律師事務(wù)所 41123
• 代理人: 樊羿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病蟲害檢疫領(lǐng)域，具體涉及一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物及其檢測方法。

背景技術(shù)

煙草根黑腐病是世界性的病害，一旦發(fā)病就會造成巨大的經(jīng)濟損失，在我國云南、貴州、湖北等主要產(chǎn)煙區(qū)發(fā)生較重，嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達30%以上。山東、河南、安徽、吉林、福建等產(chǎn)煙區(qū)也有發(fā)生，近年有加重危害的趨勢。但是，煙草根黑腐病菌作為煙草常見的一種土傳真菌，目前對其檢測還未形成特異性和高靈敏性體系。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物及其檢測方法，設(shè)計了特異性和高靈敏性的檢測引物，建立了煙草根黑腐病菌的PCR檢測體系。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

設(shè)計一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物，包括以下引物：

TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG

TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。

設(shè)計一種煙草根黑腐病菌的分子檢測方法，包括以下步驟：

（1）提取待檢測煙株、土壤或其混合材料中的總DNA；

（2）以所述總DNA為模板用上述引物對進行PCR擴增，采用20μL反應(yīng)體系，其中包括：0.2μL的5u/μL?rTaq酶，各0.4μL均為10μmol/L的TB1419-F和TB1419-R引物，1μL的總DNA，1.5μL的2.5mmol/L?dNTP，1.0μL的2.5mmol/L?MgCl₂溶液，2μL的10×PCR?Buffer，余量為ddH₂O；PCR擴增程序：95℃預(yù)變性4min，35個循環(huán)的95℃變性30?s、59℃退火50?s和72℃延伸30?s，最后在72℃延伸5?min；

（3）取所得PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，如在131bp處出現(xiàn)特異條帶，說明待檢測材料帶有煙草根黑腐病菌，反之則不攜帶。

根據(jù)上述的分子檢測方法，所述總DNA濃度不小于100fg/μL。

本發(fā)明的積極有益效果：

本發(fā)明在綜合考量DNA序列的保守區(qū)、是否形成二級結(jié)構(gòu)、G+C含量、堿基隨機分布、長度等眾多因素的基礎(chǔ)之上，并經(jīng)過必要的修飾及大量的試驗驗證，最終設(shè)計并篩選出了特異性和高靈敏性（達100fg/μL）的檢測引物，建立了特異性和高靈敏度的PCR檢測體系，通過檢測煙株病殘體和土壤的基因組序列，完成了煙草根黑腐病菌的快速準(zhǔn)確超低濃度鑒定，并進一步實現(xiàn)了對不同耕作栽培條件下病害風(fēng)險的精確預(yù)警性監(jiān)測，顯著提高了煙草根黑腐病害的防治水平，滿足煙葉生產(chǎn)上的迫切需求。

附圖說明

圖1本發(fā)明引物的特異性鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中?M?DL2000?DNA?Marker，1煙草根黑腐病菌，2煙草黑脛病菌，3鐮刀菌，4煙草赤星病菌，5煙草灰霉菌，6煙葉，7煙草角斑病菌，8煙草蛙眼病菌。

圖2本發(fā)明引物的靈敏性鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中M?DL2000?DNA?Marker，CK?ddH2O空白對照，9-16分別為基因組DNA濃度（104ng/μL）的1倍、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

一種煙草根黑腐病菌的分子檢測引物，引物對如下：

TB1419-F：GTGTTGGAGGACCCGCGTTTAG

TB1419-R：AGTTGAGGGTTTTTCGGCATGTT。

實施例2

一種煙葉中煙草根黑腐病菌的分子檢測方法，包括以下步驟：

（1）提取待檢測煙株煙葉部分的基因組DNA：

1）用無水乙醇先把研缽、研杵、鑷子灼燒滅菌，冷卻至室溫，向研缽中加入液氮對研缽和研杵進行預(yù)冷，將裝有煙葉的離心管放進液氮瓶中進行預(yù)冷，當(dāng)研缽表面結(jié)出白霜即可用來研磨；

2）將離心管中的煙葉倒入研缽，向研缽中加入適量液氮快速、用力研磨，研磨過程中要不斷添加液氮，研磨三次，研磨成均勻粉末狀態(tài)后分裝至1.5?mL離心管；