[發明專利]偶聯寡聚精氨酸及2位取代的內嗎啡肽-1類似物及其合成方法和應用

在審

• 申請號: 201510060975.8
• 申請日: 2015-02-05
• 公開（公告）號: CN104650182A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 王長林;刁玉祥;邱停停
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C07K7/02
• 分類號: C07K7/02;C07K1/06;C07K1/04;A61K38/08;A61P29/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及一種內嗎啡肽-1類似物及其合成方法和應用。

背景技術

神經肽在痛覺感受及痛覺調制方面的研究一直是神經科學研究的熱點之一。目前已發現有多種神經肽在痛覺信息的傳遞和調制過程中起重要作用，其中最為人們熟悉的就是阿片肽。

1997年，Zadina等從牛腦中發現了兩個對μ-阿片受體具有高親和性和高選擇性的內源性配體，即內嗎啡肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2,EM-1)和內嗎啡肽-1(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2,EM-2)，從而成為阿片肽研究的一個新突破。內嗎啡肽(EMs)通過與G蛋白偶聯的μ-阿片受體結合，參與對痛覺、心血管、呼吸、胃腸、運動、行為、內分泌及免疫等諸多功能的調節，但其主要作用是強效的鎮痛活性，可產生活性強于嗎啡而副作用較少的鎮痛作用。特別是它們在神經性疼痛動物模型中也表現出明顯的鎮痛活性，比大多數阿片肽都更有效，使其具有潛在的開發前景。但是，內嗎啡肽作為天然多肽類化合物，其酶解穩定性差，缺乏口服活性，不易透過血腦屏障和鎮痛效果不能持久等，這些缺點極大限制了其作為臨床鎮痛藥物的應用。近年來，對于神經肽治療學的研究已經取得了很大的進展。然而，血腦屏障通透性和生物穩定性是發展天然活性肽成為臨床藥物所必須克服的兩大主要問題，對于多肽藥物向中樞系統的運輸仍然是個很大的瓶頸。

已有報道主要有兩種酶參與了內嗎啡肽的酶解過程：一種是二肽基肽酶IV，可活潑地從內嗎啡肽的N-末端釋放二肽Tyr-Pro；另一種是氨肽酶，主要參與二級降解過程。2位Pro為二肽基肽酶IV的天然識別位點，因此對內嗎啡肽的2位Pro通過非天然氨基酸取代對于提高生物穩定性非常重要。

細胞穿膜肽，也叫蛋白轉導域，一般是由30個或者更少的氨基酸組成，能夠穿越血腦屏障。最初，Green等首先發現并證實HIV-1病毒的反式激活蛋白TAT具有跨膜轉移的功能，后經實驗證明，真正起跨膜轉運作用的其實是TAT的一段被稱為蛋白轉導域的特殊氨基酸序列(49-57位氨基酸)。之后，很多具有跨膜功能的多肽分子陸續被發現，并且這些細胞穿膜肽能夠以非受體介導的方式增強被運載分子穿越血腦屏障。可以說，細胞穿膜肽的發現為生物活性分子在細胞生物學、基因治療、藥物體內轉運、臨床藥效評價以及細胞免疫學等研究領域均具有良好的應用前景，利用細胞穿膜肽介導藥物運輸到中樞系統的應用提供了一個非常新穎有效的方法。各種小分子物質，多肽和蛋白已經被作為“貨物體”運輸到大腦中樞。

短序列的寡聚精氨酸是一種陽離子化的細胞穿膜肽。其精氨酸的主要結構特性提示胍基部分是內化作用的關鍵結構。胍基基團能夠與細胞表面的陰離子基團形成二價的氫鍵，陽離子化的寡聚精氨酸能夠通過與負價電荷的非特異靜電相互作用而強烈吸附到細胞表面。

由于內嗎啡肽-1具有優于內嗎啡肽-2的治療學特性，如獎賞行為與鎮痛作用的分離，耐受的形成較內嗎啡肽-2發展慢，鎮痛劑量明顯低于引起呼吸抑制及心血管作用的劑量等，推測內嗎啡肽-1比內嗎啡肽-2更適于作為新的安全鎮痛藥物進行研究。因此，對內嗎啡肽-1的C-末端連接細胞穿膜肽，以及2位非天然氨基酸取代的組合修飾法對于提高藥物的利用率和效能具有重要作用，有望為發展內嗎啡肽-1成為新型的臨床鎮痛劑。

發明內容

本發明是要解決目前內嗎啡肽-1的生物穩定性和外周給藥的鎮痛活性較低，對胃腸道副作用較大的問題，提供偶聯寡聚精氨酸及2位取代的內嗎啡肽-1類似物及其合成方法和應用。

本發明偶聯寡聚精氨酸及2位取代的內嗎啡肽-1類似物，是通過將內嗎啡肽-1母體的第2位天然氨基酸Pro替換為非天然氨基酸β-Pro、D-Ala或Sar，并對C-末端連接具有連接子“-(Gly)₂-”的二聚或五聚精氨酸，構建一系列新型高效的內嗎啡肽-1類似物。

本發明偶聯寡聚精氨酸及2位取代的內嗎啡肽-1類似物的結構如下：

其中AA為β-Pro、D-Ala或Sar，n為2或5。

上述偶聯寡聚精氨酸及2位取代的內嗎啡肽-1類似物的合成方法，按以下步驟進行：

一、“Fmoc”保護的Wang樹脂預處理：將1.2g帶有一個氨基酸殘基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang樹脂放入固相合成儀，加8～12mL二氯甲烷攪拌30min，減壓抽濾至抽干溶劑；

二、脫除“Fmoc”保護基團：將抽干后的溶脹樹脂用DMF洗滌3min，減壓抽濾至抽干，重復3次；